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转运siRNA的HER2靶向PEG化冻干免疫脂质体的制剂学研究

孙靖  
【摘要】:人类的许多疾病都与基因的过度表达相关,RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因沉默机制,通过RNA干扰技术沉默相关基因的表达可以治疗包括肿瘤在内的许多疾病[1]。肿瘤的基因治疗目前面临的一个非常重要问题是如何将小干扰RNA (siRNA)高效地转染入肿瘤细胞并有效发挥基因沉默效率。siRNA较易降解,而且由于细胞膜同性电荷排斥作用和肾过滤作用,使得siRNA必须借助载体运输才能有效的转染入肿瘤细胞内;虽然载体能提高siRNA的稳定性和转染效率,然而siRNA/载体复合物仍然面临网状内皮系统(RES)吞噬、从血管中外渗进入肿瘤组织、穿过肿瘤细胞膜、siRNA内涵体释放等一系列障碍和问题[2-5]。聚乙二醇(PEG)化免疫脂质体作为一种安全有效的siRNA载体,对于上述问题的解决极具潜力。 课题组前期[6]对DC-Chol/DOPE阳离子脂质体的制剂学研究已经得出一系列结果:对于DC-Chol/DOPE阳离子脂质体来说,在DC-Chol/DOPE摩尔比例为1时,siRNA的转染效率最高,随着DC-Chol/DOPE阳离子脂质体中的PEG含量的增加,siRNA的转染效率呈下降趋势。本课题正是基于前期研究结果而开展的。本研究继续对DC-Chol/DOPE阳离子脂质体进行PEG化修饰、抗HER2单克隆抗体Fab’片段(Anti-HER2 Fab’)的靶向修饰、冷冻干燥等处理,旨在得到一种对siRNA保护性更强、肿瘤靶向性更好、内涵体释放更多、基因沉默效率更高的siRNA载体。首先,我们制备得到PEG化的DC-Chol/DOPE阳离子脂质体(简称PL),然后修饰Anti-HER2 Fab得PEG化的免疫脂质体(简称PIL),最后通过冻干制得PEG化冻干免疫脂质体(简称LPIL),最后,我们对PIL、LPIL及其siRNA复合物进行一系列的制剂学研究和体外活性研究。 本文主要对PIL和LPIL的粒径、zeta电位、Fab’连接效率、siRNA包封率、siRNA血清稳定性等指标进行考察。不同PEG化的PIL或PL的粒径均为130~150 nm,不同PEG化的LPIL水化后粒径增大10~20 nm。当DC-Chol/siRNA(w/w)的比例为5/1左右时,脂质体(包括PL、PIL、LPL和LPIL)/siRNA复合物的粒径达到峰值;在该比例为10/1时,脂质体/siRNA复合物zeta电位出现拐点。SDS-PAGE证实了Anti-HER2 Fab’确实连接在LPIL上,连接效率约为20%。我们利用Quant-iT~(TM) RiboGreen~(?)法测定了PIL和LPIL的siRNA包封率,结果显示当DC-Chol/siRNA的质量比较小(3或5)时,2.5 mol% PEG的LPIL的包封率明显高于2.5% PEG的PIL (P0.01)。琼脂糖凝胶电泳证实:2.5 mol% PEG的LPIL或LPL对siRNA的保护较PIL和PL好。 在体外实验中,我们对LPIL的靶向性、不同PEG化程度对LPIL的基因沉默效率影响以及2.5 mol% PEG的LPIL的体外活性进行研究。共聚焦显微镜(LSCM)观察结果表明:LPIL能特异性靶向高表达HER2抗原的SK-BR-3乳腺癌细胞并被内吞;流式细胞仪(FCM)结果证实冻干能显著提高脂质体的基因沉默效率,而且含2.5mol% PEG的LPIL具有最佳的基因沉默效率;最后我们利用2.5 mol% PEG的LPIL转导与肿瘤细胞迁移有关的Anti-RhoA siRNA,结果表明2.5 mol% PEG的LPIL能特异性沉默SK-BR-3细胞的RohA表达(抑制率为85%)并显著抑制其迁移(抑制率为79.5%)。上述结果表明,我们制备的2.5 mol% PEG的LPIL能有效的将siRNA特异性转染入高表达HER2的乳腺癌细胞内并沉默相关基因的表达,将来有可能作为一种有效基因载体在乳腺癌的基因治疗中发挥重要作用。


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