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干扰CXCR4对前列腺癌细胞VEGF和MMP-9表达及转移的影响实验研究

王钦文  
【摘要】:研究背景 前列腺癌(prostate cancer,PCa)是老年男性泌尿系统常见的恶性肿瘤,早期即可发生转移。据报道,约70%的进展期前列腺癌可发生骨转移,患者因而遭受癌性疼痛的困扰,生活质量下降,生存期缩短。而且,前列腺癌对放化疗并不敏感,放疗和化疗并不能延长前列腺癌患者生存期。因此,深入研究前列腺癌转移的分子机制,并有效的阻止其转移对于改善前列腺癌的预后非常关键。 肿瘤转移是癌细胞与宿主细胞相互作用的连续复杂过程,这个过程需要多步骤、多因素相互作用共同完成。近年的研究表明,趋化因子受体4(chemokine CXC motif receptor 4,CXCR4)与其配体SDF-1(stromal cell-derived factor-1)结合在肿瘤的血管生成和侵袭转移中发挥重要作用。本课题组前期研究发现,CXCR4的表达与前列腺癌患者微血管密度及淋巴结转移呈正相关,提示此受体具有促进前列腺癌血管生成和转移的作用。然而,CXCR4促进前列腺癌转移的信号作用机制和治疗学意义尚需深入探讨。 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)在肿瘤发病中的作用已越来越受到重视。VEGF和MMP-9在多种肿瘤中高表达,被认为是肿瘤发生、侵袭转移、治疗拮抗以及复发的重要影响因子。然而,VEGF和MMP-9在前列腺癌转移中的具体机制尚不完全清楚,它们是否参与了SDF-1/CXCR4信号通路?其分子机制如何?而我们前期结果也证明前列腺癌高表达CXCR4,因此我们推测:前列腺癌高表达的CXCR4可能通过促进VEGF和MMP-9的产生,从而在肿瘤的转移中起重要作用。本课题拟先检测前列腺癌组织SDF-1、VEGF、MMP-9的表达,分析其与临床病理特征及预后的关系;进而用小干涉RNA(siRNA)敲低CXCR4的基因表达,观察CXCR4以及转移相关分子VEGF、MMP-9 mRNA及蛋白的表达;最后取雄性SCID小鼠,接种感染表达CXCR4基因特异性siRNA的慢病毒载体的前列腺癌PC-3细胞,观察肿瘤的生长及转移情况。通过本研究,期望明确SDF-1/CXCR4生物轴及转移相关分子VEGF和MMP-9对前列腺癌转移及其预后的影响,为最终改善其预后提供新的靶点和思路。 方法 1.收集148例手术切除的前列腺癌存档蜡块和10例前列腺增生组织(benign prostatic hyperplasia, BPH)。采用免疫组化方法检测前列腺癌组织和前列腺增生组织中SDF-1、VEGF、MMP-9蛋白的表达分布情况,并分析其与患者年龄、雄激素受体(AR)、病理分期、分化程度、淋巴结转移及预后的关系。 2.设计并合成四对针对CXCR4基因的干扰质粒(分别命名为干扰质粒A、B、C、D)和一对阴性对照质粒,瞬时转染前列腺癌PC-3细胞48h后,通过Real-timePCR筛选出干扰效率最高的质粒,构建为siCXCR4慢病毒干扰载体,并进行慢病毒包装和DNA测序鉴定。用构建成功的siCXCR4慢病毒感染体外培养的PC-3细胞,观察其对PC-3细胞CXCR4的干扰效率;并通过Real time PCR和Western blotting检测siCXCR4慢病毒载体稳定转染PC-3细胞后,肿瘤转移相关分子VEGF、MMP-9 mRNA及蛋白的表达情况。 3.分别接种人前列腺癌PC-3细胞、siCXCR4慢病毒转染的PC-3细胞于雄性SCID小鼠皮下,建立SCID小鼠人前列腺癌移植瘤模型,观察接种后小鼠的活动情况、肿瘤生长及转移情况,并以免疫组化检测肿瘤转移相关因子VEGF和MMP-9在小鼠原发灶和转移灶中的表达情况。 结果 1.148例PCa组织中VEGF和MMP-9的表达率显著高于前列腺增生组织(P0.001, P=0.004)。虽然SDF-1在前列腺癌组织中与前列腺增生组织中的表达无明显差异(P=0.052),但在148例PCa中,有131例SDF-1阳性表达(131/148,88.5%)、148例VEGF阳性表达(148/148,100%)和132例MMP-9阳性表达(132/148,89.1%);而且SDF-1、VEGF、MMP-9高表达率(其中++和+++为高表达)分别为18.9%(28/148)、66.2%(98/148)、39.1% (58/148);前列腺癌组织中SDF-1、VEGF、MMP-9蛋白的高表达与患者的病理分期、肿瘤的分化程度及淋巴结转移有关,与患者年龄及AR无关;SDF-1、VEGF、MMP-9高表达患者的5年生存率分别为50.5%、70.2%、69.2%,而低表达者的5年生存率分别为85.6%、94.3%、85.6%,两者之间有显著差异(log P﹤0.05)。单因素和多因素COX回归分析进一步表明,SDF-1和VEGF是前列腺癌患者的独立预后因子。 2.合成的四对人CXCR4干扰质粒和一对阴性对照质粒瞬时转染前列腺癌PC-3细胞48h后,各质粒组CXCR4mRNA的抑制率分别为63.3±21.7%、25.3±24.9%、48.9±13%、34.8±39.4%,与阴性质粒对照组细胞(0±42.6%)相比较,各感染组对CXCR4mRNA的表达均有不同程度的抑制作用(P0.05),其中干扰质粒A的抑制作用最强。将干扰质粒A构建为慢病毒载体,经测序鉴定干扰质粒能准确完整的导入慢病毒载体中。将成功构建的针对CXCR4的siRNA(siCXCR4)慢病毒载体稳定转染人前列腺癌细胞PC-3后,与阴性对照载体组相比,CXCR4 mRNA及蛋白水平明显降低(P0.05)。同时,阴性病毒感染组VEGF和MMP-9 mRNA表达与未感染组比较无明显差异(P0.05),siCXCR4慢病毒感染组VEGF和MMP-9 mRNA表达与未感染组比较明显降低(P0.05)。Western blotting检测发现阴性病毒感染组和未感染组VEGF和MMP-9蛋白表达无显著差异,siCXCR4慢病毒感染组较未感染组VEGF和MMP-9蛋白表达明显降低。 3.SCID小鼠皮下移植瘤实验观察发现,PC-3组SCID小鼠瘤细胞成瘤时间较短(PC-3组最早第35天开始扪及腹部肿瘤结节,siCXCR4慢病毒感染组最早第45天开始扪及腹部肿瘤结节),肿瘤体积较大(2.16±0.05cm3 vs 0.32±0.03cm3, P0.05),转移灶数目较多,其中1例发生骨转移,位于小鼠腰柢椎,而干扰组无骨转移发生。在SCID小鼠原发灶,PC-3组的VEGF和MMP-9的表达明显高于干扰组(P0.05),但在SCID小鼠转移灶中,两者表达分布呈强弱不等。 结论 1.前列腺癌组织中SDF-1、VEGF是患者预后的独立危险因子。 2.人CXCR4基因慢病毒干扰载体构建成功,其感染前列腺癌细胞效率高、基因沉默效果稳定。干扰CXCR4表达后,能够抑制PC-3细胞VEGF和MMP-9蛋白的分泌和mRNA的表达,表明在前列腺癌细胞中,CXCR4对VEGF和MMP-9的表达起重要的调控作用。 3.siCXCR4慢病毒感染组细胞体内注射后可抑制小鼠前列腺癌移植瘤的生长、远处转移及其VEGF和MMP-9的表达。提示CXCR4通过调控VEGF和MMP-9的表达参与了前列腺癌的转移过程。但是,在小鼠转移灶中后二者的表达呈强弱不等,表明可能还有其它信号通路参与调控了前列腺癌转移过程中的相关分子VEGF和MMP-9的表达。


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