RANKL/RANK途径对人乳腺癌细胞迁移作用及其调节机制的研究

【摘要】：研究背景 乳腺癌是女性患病和死亡人数最高的恶性肿瘤,远处转移是乳腺癌致死的主要原因。包括乳腺癌在内的许多恶性肿瘤的转移并非随机迁徙,而是有固有路径和特定的转移器官。骨骼是乳腺癌细胞容易转移的部位,远超过肝、肺等部位转移,但是乳腺癌嗜骨转移的机理迄今为止尚待进一步阐明。 核因子κB受体活化因子(RANK)和其配体即RANKL对骨骼改建、免疫系统成熟有重要作用。骨保护素(OPG)作为游离的诱饵受体,能够和RANK竞争性结合RANKL。陆续有研究发现RANK或RANKL在原发性骨肿瘤和易发生骨转移肿瘤的细胞上表达,于是人们开始关注RANKL和RANK相互作用对肿瘤细胞生物学功能以及肿瘤嗜骨性转移的影响和作用。先前研究显示RANKL能够诱导部分RANK阳性的肿瘤细胞发生趋化迁移。我们假设骨骼中成骨细胞等细胞通过RANKL/RANK途径诱导循环系统中的肿瘤细胞迁移至骨,最终形成骨转移。目前关于RANKL对RANK阳性乳腺癌细胞诱导迁移的机制尚未完全阐明;此外,乳腺癌细胞中RANKL/RANK表达的调控因素仍鲜有报道。因此,本课题以人乳腺癌细胞为研究对象,在证实RANKL/RANK途径促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的基础上,明确参与RANKL诱导乳腺癌细胞迁移的下游信号分子,并研究了缺氧微环境对乳腺癌细胞RANKL/RANK途径的调节及其可能的机制。 研究方法 第一部分RANKL/RANK途径对人乳腺癌细胞迁移能力的影响 首先通过体外细胞划痕实验和Transwell趋化小室实验,证实RANKL对MDA-MB-231细胞趋化迁移能力的影响。同时用OPG预处理RANKL后,观察对RANKL诱导的细胞迁移的影响。其次,将能够表达、分泌RANKL的人成骨细胞hFOB1.19与MDA-MB-231细胞共培养,观察前者对后者的趋化作用。最后,针对目的基因RANK设计短发卡RNA(shRNA)干扰序列,构建质粒,进行慢病毒包装后感染MDA-MB-231细胞。此外获得RANK基因(TNFRSF11A)片段并用PCR方法扩增,通过基因重组改建成穿梭质粒pLenti-TNFRSF11A-Neo,进行慢病毒包装后感染MDA-MB-231细胞。使用流式细胞仪分选或G418筛选后,RT-PCR和Western blot分别检测干扰或过表达细胞RANK mRNA以及蛋白的表达水平。通过体外Transwell小室实验观察干扰或过表达RANK对RANKL诱导细胞迁移的影响。 第二部分RANKL诱导乳腺癌细胞迁移下游信号分子的探讨 首先使用RANKL作用于MDA-MB-231细胞,在不同时间点终止培养,提取细胞总蛋白,Western blot检测细胞中磷酸化Src表达水平的变化;使用不同剂量RANKL或加入OPG分别作用于MDA-MB-231细胞,Western blot检测细胞中磷酸化Src表达水平的变化。shRNA干扰RANK表达,观察RAKL作用后磷酸化Src表达变化。使用Src抑制剂或小干扰RNA(siRNA)干扰Src表达,Transwell小室实验观察RANKL诱导的MDA-MB-231细胞迁移的变化。 Western blot检测不同作用时间和不同剂量RANKL对细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(JNK)以及p38磷酸化表达的影响;加入OPG、Src抑制剂观察上述激酶磷酸化水平表达的改变。Western blot检测干扰Src对RANKL诱导p-ERK1/2、p-JNK以及p-p38表达的影响。使用ERK1/2, JNK, p38抑制剂预处理MDA-MB-231细胞,观察对RANKL诱导细胞迁移的影响 第三部分缺氧环境对乳腺癌细胞RANKL/RANK表达的调节及机制探讨。 分别在缺氧(0.1% O2)和常氧环境中培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞,RT-PCR检测缺氧不同时间RANK和RANKL mRNA表达水平的变化,同时使用Western blot检测相应时间点RANK和RANKL和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白的表达水平。siRNA干扰MDA-MB-231细胞HIF-1α表达后,Western blot检测缺氧环境下RANK和RANKL mRNA表达水平的变化。同时,Western blot检测观察缺氧对磷酸化Akt表达的影响,抑制PI3K/Akt后对缺氧诱导RANK和RANKL和HIF-1α蛋白的表达的影响。最后使用体外细胞划痕实验观察缺氧是否增加RANKL诱导的MDA-MB-231细胞的迁移,并通过干扰HIF-1α表达或抑制PI3K/Akt,观察细胞迁移的变化。 研究结果 (1)RANKL能够诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞趋化迁移(P0.05),而且这一作用随RANKL剂量的增加逐步增强,呈剂量依赖性特点。OPG能够有效抑制RANKL诱导的乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移,当OPG与RANKL比例达到5:1时,抑制的作用最明显。 (2)共培养人成骨细胞hFOB1.19与MDA-MB-231细胞,hFOB1.19细胞能够趋化MDA-MB-231细胞向其迁移(P0.05),这一作用能够被OPG抑制。 (3)成功设计并筛选了针对RANK的shRNA序列,通过慢病毒载体能够有效的干扰RANK在MDA-MB-231细胞的表达。同时也构建了RANK过表达的慢病毒载体,检测显示能够明显提高RANK在MDA-MB-231细胞的表达。改变MDA-MB-231细胞RANK受体表达水平,并能够影响RANKL诱导的细胞迁移,同时慢病毒载体的构建为今后更深入的研究奠定基础。 (4)RANKL作用于MDA-MB-231细胞能够促进Src激酶的磷酸化并呈时间和剂量依赖性的特点。干扰RANK的表达可以阻断RANKL诱导的Src激酶磷酸化。使用Src抑制剂或干扰Src的表达能够抑制RANKL对MDA-MB-231细胞的迁移(P0.05)。 (5)RANKL同样能够增加MDA-MB-231细胞中ERK1/2、p-38、JNK磷酸化的表达水平。干扰或抑制Src激酶,能够抑制ERK1/2、p-38、JNK的磷酸化水平。抑制ERK1/2、p-38、JNK同样能够抑制RANKL/RANK通路诱导的MDA-MB-231细胞迁移(P0.05)。 (6)缺氧培养能够增加MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞RANK和RANK的mRNA和蛋白的表达(P0.05),同时缺氧诱导的HIF-1α蛋白的表达和RANK、RANKL表达的趋势是一致的。RNA干扰HIF-1α的表达,抑制了缺氧期间(4 h～12 h)RANK、RANKL表达的上升;缺氧能够增加Akt磷酸化的表达水平,抑制PI3K/Akt通路可以抑制缺氧诱导的HIF-1α蛋白的表达,同时也抑制了缺氧期间(4 h～12 h)RANK、RANKL蛋白表达的增加。 (7)缺氧促进了RANKL诱导的乳腺癌MDA-MB-231向划痕部位的迁移(P0.05)。通过RNA干扰HIF-1α或抑制PI3K/Akt能够和OPG一样抑制缺氧对乳腺癌细胞迁移的影响(P0.05)。 结论 (1)RANKL能够诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞发生趋化迁移,这一过程参与了成骨细胞对乳腺癌细胞的趋化迁移。 (2)Src-MAPKs(ERK1/2, p38, JNK)作为下游信号分子参与了RANKL对MDA-MB-231细胞趋化迁移。 (3)缺氧可以通过PI3K/Akt-HIF-1α途径调节人乳腺癌细胞RANK、RANKL的表达水平,并能影响细胞的迁移能力。