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肠出血性大肠杆菌O157:H7 E07表位的免疫学性质研究和IL-9/CD4~+IL-9~+T细胞在幽门螺杆菌感染中的作用研究

余抒  
【摘要】:肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC ) O157:H7(本文简称EHEC O157)与宿主肠道上皮细胞的粘附是细菌感染的第一步。介导细菌粘附定植的主要结构是Ⅲ型分泌系统(type-III secretion system,TTSS),其结构类似“注射器”将效应蛋白从细菌胞浆注射到宿主细胞内,引发宿主细胞功能紊乱及细菌感染。EspA (Esp为E. coli secreted protein缩写)作为Ⅲ型分泌系统的主要元件,呈中空的三维立体管道结构,是连接细菌与宿主的关键桥梁。编码EspA蛋白的基因全长579bp,其蛋白分子量约为25kDa,以多聚体形式存在,具有很强的免疫原性,在EHEC O157致病中发挥重要作用。 在前期的实验研究中,我们通过杂交瘤技术筛选到了一株具有中和活性的抗EspA单克隆抗体1H10,并且对抗体的纯度、亲和力、特异性,以及免疫识别能力做了鉴定;接下来我们利用生物信息学预测及表位作图相结合的方法,首先分段表达相互重叠的6个EspA蛋白片段,利用免疫印迹筛选到了抗体1H10特异结合的EspA蛋白片段;进一步运用步移合成多肽结合免疫印记技术最终将抗体1H10特异性识别的表位精确定位于EspA第100-120位氨基酸,命名为E07。 本研究拟对E07表位的免疫学功能进行研究,以期揭示E07在EHEC O157感染致病中的作用,为E07作为表位疫苗的应用性研究奠定理论基础,为找到有效地预防和治疗EHEC O157感染及传播流行的优势表位疫苗提供重要的实验依据。 方法: 1. E07表位的抗原性分析 1) E07免疫BALB/c小鼠,ELISA检测血清抗体效价,检测E07的免疫原性。 2)免疫印迹(Western blotting, WB)和免疫荧光实验分析产生的抗E07多克隆抗体与天然及重组EspA蛋白的免疫反应性。 3) ELISA检测人及小鼠、家兔来源的EHEC O157血清抗体与E07的结合反应。 2. E07表位的免疫保护作用及机制研究 1)通过肌动蛋白染色(fluorescent actin staining, FAS)实验检测E07抗体阻断O157引发A/E损伤的能力。 2)动物攻毒保护实验检测E07表位的免疫保护效力。 3)病理组织学实验检测E07免疫后小鼠肠道组织病理改变。 3.生物信息学分析:采用BLAST分析E07表位氨基酸序列在致病性大肠杆菌中的同源性。 结果: 1. E07能刺激BALB/c小鼠产生特异性的抗体(IgG),且抗体效价达1:25600;同时,一方面E07多抗血清能够识别EHEC O157天然EspA及重组EspA蛋白,另一方面E07能够特异的结合O157多抗血清。 2.通过肌动蛋白聚集及抗体阻断实验,证明了由E07产生的抗体对宿主细胞A/E损伤的阻断效应。 3.通过动物攻毒保护实验证实E07作为免疫原能够引起机体产生针对防御EHEC O157较强的免疫应答反应,进而起到免疫保护作用。 4.病理学实验结果证实E07的多抗血清在阻断肌动蛋白聚集的同时也能够减缓O157感染机体后的肠道病理组织损伤。 5.同源比对结果证实E07在不同血清型致病性大肠杆菌中,氨基酸序列同源性达80%以上,具有交叉反应性。 结论: 1. E07表位具有良好的抗原性及免疫保护效力,可作为EHEC O157疫苗的理想候选抗原成分。 2.由E07免疫机体产生的特异性抗体在阻断肌动蛋白聚集及抑制A/E损伤形成中发挥了重要的生物学功能。 3. E07表位在致病性大肠杆菌中具有很高的同源性,表明E07不仅可以作为EHEC O157的候选疫苗成分,同时可能对其它致病性大肠杆菌也具有交叉保护效力。 4.此外,识别E07的单克隆抗体1H10不仅可以直接作为研究EspA活性功能的示踪工具,而且1H10在治疗性抗体药物研发中也具有潜在的应用前景。 H.pylori持续性感染可引发机体慢性胃炎、胃溃疡甚至胃癌等胃肠道相关疾病的发生,阐明H.pylori致病机制对加强其感染的免疫防治具有重要的理论指导意义。H.pylori感染后会激活机体强烈的免疫应答反应,包括CD4~+T细胞的各细胞亚群Th1、Th2及Th17等均参与了H. pylori感染的免疫应答,但这类免疫反应不但不能有效清除感染的H. pylori,反而引发机体慢性持续化的炎症病程,表明CD4~+T细胞在H. pylori感染慢性持续化过程中发挥重要作用。CD4~+ IL-9~+ T细胞作为一群新的CD4~+T细胞亚群,在H. pylori感染中的作用未见报道,研究此类T细胞亚群在H. pylori感染中的作用,将有利于我们深入了解H. pylori感染的致病机理,对H. pylori感染的免疫防治具有重要的意义。 我们通过实验研究发现,细胞因子IL-9参与了H. pylori感染,是否IL-9与该菌感染引发的免疫反应密切相关?为进一步明确IL-9在H. pylori感染中的免疫损伤作用和机制,拟以分泌IL-9的这群CD4~+T细胞作为研究对象,通过研究IL-9及CD4~+ IL-9~+ T细胞在H. pylori感染进程中的应答变化,分析IL-9/CD4~+ IL-9~+ T细胞与H. pylori感染的相关性,探索IL-9/CD4~+ IL-9~+ T细胞在H. pylori感染性炎症中的免疫功能,以期阐明IL-9/CD4~+ IL-9~+ T细胞在H. pylori慢性感染中的作用,从而为揭示H. pylori感染的免疫致病机制寻找新的线索,为H. pylori免疫防治提供理论依据。 方法: 1.建立H. pylori感染BALB/c及C57BL小鼠动物模型:组织病理检测炎症程度,Real time PCR检测胃组织H. pylori定植量,根据国际炎症评分标准对胃组织验证评分,评价H. pylori感染效果。 2.分别在基因和蛋白水平检测不同时相点胃组织、胃旁系淋巴结、肠系膜淋巴结以及脾脏IL-9 mRNA及蛋白水平,检测相关细胞因子IFN-γ、IL-17及IL-4在H. pylori感染中的应答状态,分析IL-9在H. pylori感染中的应答规律,以及与H. pylori感染引发慢性炎症的关系。 3.流式检测脾淋巴细胞CD4~+ IL-9~+ T细胞的应答变化,ELISA检测细胞培养上清细胞因子IL-9的表达水平,从细胞学水平验证CD4~+IL-9~+T细胞与H. pylori感染的相关性。 4.检测感染H. pylori的临床标本IL-9/CD4~+ IL-9~+ T细胞的应答改变,进一步分析在H. pylori感染状态下Th9/IL-9的免疫应答反应。 结果: 1.通过病理组织学检察、胃组织H. pylori定植量分析确定H. pylori感染BALB/c及C57BL小鼠动物模型成功建立。 2.通过检测H. pylori感染后细胞因子的应答,结果显示IFN-γ应答早于IL-17及IL-9,IL-4的应答在整个感染进程中变化不明显。 3. H. pylori感染BALB/c及C57BL小鼠细胞因子应答中,IFN-γ的应答在C57BL小鼠较高,该结果与其他研究报道相符,而IL-9在两种品系小鼠中无明显差别。 4. IL-9在感染的不同时相点应答具有一定的规律,应答首先发生在胃旁进而引发胃组织的免疫反应,炎细胞及趋化因子随血液、淋巴液进入脾脏,引发脾淋巴细胞的应答,随感染周期的延长,应答最后又归巢到H.pylori感染和定植的胃组织,在感染期间消化道的另一免疫器官肠系膜淋巴结也有相应的应答改变,但变化不明显。 5.通过流式及免疫相关检测技术检测了机体CD4~+IL-9~+T细胞的应答,结果显示在H.pylori感染的小鼠脾淋巴细胞及人PBMC都有CD4~+IL-9~+T细胞的表达,提示CD4~+IL-9~+T细胞的应答与H. pylori感染密切相关。 结论: 1. H. pylori感染后可诱导细胞因子IL-9的应答,其中IL-9 mRNA和蛋白水平均在炎症中后期有明显增高,并且与炎症程度呈正相关。 2.分泌IL-9的CD4~+T淋巴细胞参与H.pylori感染,并且该细胞可能来源新的细胞亚群“Th9”,提示Th9/IL-9在H. pylori引发慢性持续性免疫病理损伤中发挥了重要作用。


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