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TLR4信号通路在大鼠慢性应激心肌损伤中作用的研究

王荣平  
【摘要】:一、研究背景和目的 应激为机体在各种内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应。军事应激是指军人在完成军事任务过程中对极端恶劣生存环境、精神超负荷紧张及超强度作业等在内的多种因素反应过程,包括心理、生理上的变化。适度应激反应往往能活化思维、提高军人的警觉性和作业效率,但当应激压力导致军人的认知、情绪和行为发生改变、严重降低作业效率时,则表现为军事应激障碍。 心脏是应激作用的主要靶器官之一。研究发现多种心脏疾病的发生和发展与应激机制的激活密切相关,神经体液因素特别是炎症细胞因子的释放是重要机制。Toll样受体是一种膜受体,在机体防感染免疫中起关键作用,能被机体“危险”信号如:应激、损伤、坏死等激活。在心脏中主要表达TLR4。TLR4激活使得信号转导到胞内,在一系列酶的作用下,NF-κB活化,转入细胞核中诱导特定基因的表达,导致炎症因子产生。 TLR4/NF-κB通路在慢性应激心脏中的作用还不清楚。为搞清上述问题,本课题建立了大鼠慢性应激模型,观察慢性应激对心肌的影响,研究TLR4/NF-κB、IL-6、TNF-α等和心肌损伤的关系,希望探索TLR4/NF-κB在慢性应激心脏中的作用,为慢性应激致心肌损伤防治提供实验依据。 二、材料和方法: 第一部分:军事训练应激对战士心血管系统影响的观察选取连队健康男性战士64人,年龄18-20岁,同时选取健康男战士10名做对照。军事训练应激为3公里越野加5分钟数学运算,军事训练前后检测BP、HR、EKG和SCL-90量表,并于训练后抽血查血常规、C-RP、心肌酶谱、ACTH、皮质醇、TNF-α、IL-6。对照组只抽血,不参加军事训练。 第二部分:大鼠慢性应激致心肌损伤及NAC防治作用研究 选用雄性SD大鼠,6-7周龄,体重180-220g,动物随机分为对照组和实验组,实验组又分为应激1d、1w、2w、3w、4w、NAC组,每组8只。实验组采用每天束缚6h+强迫游泳15min应激模式,NAC组在应激同时每日给予NAC150mg/kg灌胃,持续2周。实验期间每3天称1次体重,每天观察大鼠行为变化。 各组于试验结束次日处死大鼠。处死前连续记录5分钟心率、EKG变化,记录血压变化。分离血清,同时留取心尖部心肌标本做TLR4 mRNA、NF-κB、电镜、病理和心肌匀浆等检查。对照组不应激,和实验组大鼠同时处死取材。 心肌酶CK测定采用ABC-ELISA方法,LDH、AST用全自动生化分析仪自动检测。HE染色观察病理形态变化,同时根据心肌出血、水肿和渗出情况对心肌损伤进行评分,透射电镜观察心肌超微结构变化。采用Tunel法观察心肌细胞凋亡情况,用免疫组化方法观察心肌组织iNOS表达。 第三部分:TLR4信号通路在慢性应激大鼠心肌表达和意义的研究 实验动物及分组同第二部分。用RT-PCR方法测定心肌TLR4mRNA表达,用EMSA方法测定心肌NF-κB活性,用ELISA方法测定心肌匀浆TNF-α、IL-6含量,用免疫组化方法观察心肌组织TNF-α、IL-6表达。 统计方法 所有数据均用平均数±标准差表示,样本均数比较用t检验,组间比较用单因素方差分析,P 0.05认为有统计意义。 三、结果: 第一部分: 急性军事训练前后对比,应激后战士HR(次/分)增快(82.17±15.38 vs 69.70±10.19, P0.01),DBP(mmHg)(78.90±8.40 vs74.68±8.68, P0.01)升高。C-RP(mg/L)和对照组比较升高(2.05±9.36 vs 1.56±0.95,P0.05)。6名战士EKG表现为窦性心动过速,1名表现为频发房性早搏、短阵二联律,1名表现为ST段抬高,其中V1导联0.2mV。SCL-90量表9项分数每项和训练前比,均无显著性差异。训练后血浆ACTH、皮质醇、心肌酶谱、HB、HCT、WBC、TNF-α、IL-6等和对照组相比,无显著性差异。 第二部分: 1、建立了“束缚+强迫游泳”慢性应激大鼠模型。应激大鼠出现明显行为变化,体重增长明显减慢,血清皮质酮含量(nmol/L)从应激2周开始逐渐升高,应激2、3、4周和对照组比较差异有显著性(80.35±15.63,88.64±13.21,85.68±26.38 vs 63.04±9.91, P0.05,P0.05,P0.05)。 2、应激大鼠EKG变化:在应激1天组观察到3例室上性心动过速,4周组观察到1例室上性心动过速,在应激3、4周组,各观察到1例室性早搏,在NAC组观察到1例房颤。 3、慢性应激大鼠心肌酶学和病理、超微结构变化 和对照组比较,血浆CK(u/L)在应激1天组(595.51±53.78 vs 466.95±83.19,P0.05)和1周组(574.61±50.33 vs 466.95±83.19, P0.05)明显升高,血浆LDH(u/L)在应激1周组明显升高(4132.67±716.99 vs 1616.80±672.99, P0.01),血浆AST(u/L)在应激1天组(370.5±125.02 vs131.6±36.24,P0.01)和1周组明显升高(260.40±98.77 vs 131.6±36.24, P0.01)。 病理结果显示:应激后大鼠心肌HE染色表现为心肌浊肿,间质血管扩张充血,心内膜下部分区域水肿,部分心内膜及瓣膜黏液变性,以应激1、2、3周组表现明显。应激2周组心肌损伤总评分较对照组明显增高(7.3±1.6 vs 2.7±0.5, p0.01)。电镜结果显示:内皮细胞变性,心肌细胞、内皮细胞核浓缩,心肌细胞水肿,细胞外基质成分溶解消失,胞质、线粒体肿胀,内皮下结缔组织增厚,可见脂质沉积。以应激3、4周组表现明显。 4、应激1d、1w、2w、3w、4w周组心肌细胞凋亡数和对照组比较明显增加,差异有显著性( 27.13%±5.12%, 34.82%±7.98%, 31.51%±15.31%, 21.15%±2.60%, 25.83%±3.77% vs 10.31%±2.01%。P0.01, P0.01, P0.01, P0.05, P0.01),应激各组心肌均有iNOS表达,以1-3周最明显。 5、NAC干预后,应激心肌心内膜病理改变明显减轻,水肿减轻,渗出减少,NAC治疗组心肌损伤评分总分较2周应激组明显减低(4.2±0.5vs7.3±1.6,P 0.01),但仍高于对照组(4.2±0.5vs2.7±0.5, P 0.01)。NAC组心肌细胞凋亡明显减少,和2周应激组比较,差异有显著性(16.01%±2.66% vs 31.51%±15.31% , P0.05), NAC组心肌细胞iNOS表达也较2周应激组减少。 第三部分: 1、应激大鼠心肌TIR4mRNA表达增高。TLR4表达在应激1周组升高,持续到3周组,4周组降到正常水平,1-3周组表达情况和对照组相比,差异有显著性(1.15±0.30,1.10±0.19,1.18±0.29 vs 0.88±0.10。P0.05,P0.05,P0.05)。应激大鼠心肌NF-κB活性增强。NF-κB活性在应激1天组增高,应激1周组降低,,应激2周组又升高,此后逐渐下降, 4周组下降到正常水平。应激1天组、2周组(7.75×105±3.31×105,6.96×105±3.08×105)和对照组(2.65×105±1.47×105)相比差异有显著意义(P0.01,P0.01)。 应激大鼠心肌TNF-α和IL-6含量增高,表达增强。心肌匀浆IL-6和TNF-a水平在慢性应激后逐渐升高,至4周达高峰,和对照组相比,4周组IL-6(pg/g protein)(2174.28±742.14 vs 1285.14±462.4,P0.05)和TNF-a(ng/g protein)(6.69±1.90 vs 3.80±2.35, P0.05)水平均升高。免疫组化显示应激各组心肌胞浆中均可见TNF-a和IL-6表达。 2、NAC治疗组NF-κB活性和应激2周组比较有明显降低,心肌匀浆IL-6(pg/g protein)(801.42±115.58 vs 1835.95±834.95, P0.01)和TNF-a(ng/g protein)(1.30±0.60 vs 5.48±1.88, P0.01)水平较应激组明显降低。 四、结论 1、军事训练急性应激后战士出现了心率增快、舒张压升高等表现,C-RP升高,部分战士EKG出现了窦性心动过速、频发房性早搏、ST段抬高等表现。说明军事训练后可以出现心血管方面的改变。 2、成功建立了大鼠“束缚+强迫游泳”慢性应激模型。应激大鼠皮质酮含量从应激后2周开始升高,出现了明显的焦虑、倦怠、反应低下、食欲减少、体重增长减慢等变化。 3、慢性应激大鼠血浆心肌酶升高,心肌病理和超微结构出现了改变,心肌细胞凋亡增加,部分大鼠出现了室上性心动过速、室性早博、房颤等心律失常表现,表明慢性应激可导致大鼠心肌损伤。 4、慢性应激大鼠心肌TLR4表达增高,NF-κB活性增强,心肌IL-6、TNF-α含量和表达增高。应用NAC可抑制NF-kB的活性和IL-6、TNF-α的表达,减轻心肌损伤。说明TLR4/NF-κB信号通路的激活可能是慢性应激心肌损伤的重要机制,并可能是防治慢性应激致心肌损伤的新的靶点。


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