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姜黄素抑制BLyS表达的分子机制及其在抗类风湿性关节炎中的作用

黄刚  
【摘要】:类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一常见的自身免疫性疾病,具有较高致残率,严重影响患者的生活质量。RA的发病机制不仅涉及T淋巴细胞活化,而且与B淋巴细胞过度活化与功能亢进有密切联系,近年研究表明B淋巴细胞在RA的防治中有重要作用。TNF家族的B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS)是主要表达于B淋巴细胞的重要致炎细胞因子,其过表达与RA的发生和发展密切相关,抑制BLyS表达或生物学活性的发挥,无疑有利于RA的防治。姜黄素(Curcumin)是姜黄色素中最重要的活性成分,研究表明,姜黄素具有抗炎、抗氧化、免疫调节等广泛的药理作用,在抗RA等自身免疫性疾病方面具有明显的应用前景,但其发挥抗炎作用的分子机制尚未明了,特别是其抗RA的机制是否与调节BLyS有关目前尚未见报道。为此,我们针对该问题进行了系列研究,探讨了姜黄素对BLyS的调节作用及其在抗RA中的作用,结果表明,姜黄素可抑制基础水平和IFN-γ诱导的BLyS表达,而且在小鼠胶原诱导的关节炎(Collagen induced arthritis,CIA)模型中有抗炎作用并抑制体内的BLyS表达,“通过抑制BLyS表达而发挥抗炎作用”可能是姜黄素抗RA的一个新机制。 第一部分姜黄素可抑制基础水平BLyS的表达 目的:以人B淋巴细胞为模型,探讨姜黄素对基础水平BLyS表达的抑制作用,阐明该抑制作用的可能分子机制。 方法及结果: 1.在人B淋巴细胞Namalwa和Daudi中,经RT-PCR及Real-time PCR证实姜黄素可抑制基础水平BLyS mRNA的表达;经Western blot证实姜黄素可抑制基础水平BLyS蛋白的表达。 2.构建了包含不同长度BLyS基因启动子区荧光素酶(Luciferase,Luc)报告基因重组质粒,经Luc报告基因检测实验证实,姜黄素可抑制基础水平BLyS基因启动子区的活性,且该抑制作用与-1082~-571区域密切相关。 3.经电泳迁移阻滞实验(Electrophoresis mobility shift,EMSA)实验证实,NF-κB能特异性结合于BLyS基因启动子区?874~?858序列,姜黄素呈时间依赖性和剂量依赖性抑制NF-κB与该区域的结合。 4.经染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay ,ChIP)实验证实,姜黄素可在B淋巴细胞内抑制NF-κB的p65亚基与BLyS基因启动子区?874~?858结合。 5.经激光共聚焦、Western blot证实,姜黄素可抑制p65核转位及IκBα的磷酸化。结论:在人B淋巴细胞Namalwa和Daudi中,姜黄素可抑制基础水平BLyS的表达,该抑制作用的可能机制是其抑制了NF-κB信号通路。 第二部分姜黄素对IFN-γ诱导BLyS表达的抑制作用 目的:在人B淋巴细胞细胞中,探讨姜黄素对IFN-γ诱导BLyS表达的抑制作用,阐明该抑制作用的可能分子机制。 方法及结果: 1.在B淋巴细胞Namalwa和Daudi中,经RT-PCR、Real-time PCR及Western blot证实了姜黄素可抑制IFN-γ诱导的BLyS表达。 2. Luc报告基因检测实验证实,姜黄素可抑制IFN-γ诱导的BLyS基因启动子区活性。 3.经RT-PCR、Real-time PCR及Western blot证实,JAK2抑制剂(AG 490)可阻断IFN-γ对BLyS表达的诱导作用。 4.经Western blot证实,姜黄素可抑制IFN-γ诱导的STAT1磷酸化。结论:在人B淋巴细胞中,姜黄素可抑制IFN-γ诱导BLyS的表达,该抑制作用是由于抑制了JAK2-STAT1信号通路。 第三部分姜黄素在小鼠CIA模型中抑制BLyS的表达及抗炎作用 目的:建立用于RA研究的小鼠CIA模型,并探讨姜黄素在该动物模型上的抗炎作用以及抗炎过程中对BLyS表达的抑制作用,以揭示“通过抑制BLyS表达而发挥抗炎作用”是姜黄素抗RA的一个新机制。 方法及结果: 1.将牛Ⅱ型胶原经尾根部皮下注射于8周龄雄性DBA/1小鼠,制备小鼠Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)模型。 2.以关节炎指数对小鼠模型的炎症情况进行评分,证实了(1)姜黄素预处理后对CIA的炎症有一定预防作用;(2)在已建立的CIA模型上,姜黄素处理对炎症有治疗作用。 3.经ELISA检测小鼠血清中炎性细胞因子BLyS、IFN-γ、IL-6水平,证实了姜黄素抗炎过程中可抑制上述炎性细胞因子的水平。 4.经RT-PCR及Western blot证实了姜黄素在抗炎过程中可下调小鼠脾脏组织中BLyS的表达。 结论:在小鼠CIA模型中,姜黄素对关节炎的进程有预防及缓解作用,“通过抑制BLyS表达而发挥抗炎作用”可能是姜黄素抗RA的一个新机制。


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