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腺苷A3受体激活在大鼠实验性蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及机制研究

罗春霞  
【摘要】:背景和目的 蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是一类临床常见的脑血管危急重症,具有死亡率高、致残率高、发病多见于中青年的特点,严重威胁人类健康和生命。近年来的研究认为蛛网膜下腔出血后继发的早期脑损伤(Early brain injury,EBI)可能是SAH后早期致死致残的主要原因。研究如何减轻SAH后继发早期脑损伤对提高蛛网膜下腔出血患者的生存率及改善预后具有重要的意义。 早期脑损伤是最近几年提出来的一个新概念,指从动脉瘤破裂出血那一刻到血管痉挛发生前这一约72h时间窗的整体性的脑损伤,是从整体的角度来看待蛛网膜下腔出血后脑内发生的一系列病理损伤,其确切机制尚不完全明确,目前研究认为EBI可能是多因素、多途径的病理过程。大量研究表明炎症反应在SAH后早期脑损伤的形成中起着重要的作用。干预或减轻蛛网膜下腔出血后脑组织炎性损伤可能是减轻早期脑损伤,降低死亡率的一条新策略。 腺苷(adenosine,ADO)是内生性三磷酸腺苷(ATP)的代谢产物,通过其四种受体蛋白(A1、A2A、A2B、A3 receptors)参与多种致病因素引起的疾病过程。近年来腺苷A3受体亚型的抗炎特性越来越受到研究者的重视。研究表明,腺苷A3受体活化在类风湿性关节炎、肺炎、心肌梗塞等病理条件下能够减轻炎症反应从而对机体发挥保护作用。更有大量体外研究观察到腺苷A3受体参与小胶质细胞、中性粒细胞、T细胞、星形胶质细胞等免疫炎性细胞活化的调控,调控多种炎症介质的释放。研究证实A3受体在原代培养的小胶质细胞、BV2及N9小胶质细胞株等小胶质细胞上均有表达,腺苷对LPS诱导的小胶质细胞的炎症因子释放的抑制,可能通过激活A3受体发挥抗炎作用。由此我们假设,激活腺苷A3受体可能通过抑制小胶质细胞活化,减轻IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症介质的释放,减轻炎症介质对神经元直接毒性损伤和血脑屏障通透性损害,从而减轻早期脑损伤的脑水肿程度,发挥对SAH后早期脑损伤的神经保护作用。 为了验证上述假设,本研究分三部分进行,第一部分采用颈内动脉线栓刺破法建立大鼠实验性蛛网膜下腔出血模型,观察予以腺苷A3受体特异性激动剂Cl-IB-MECA干预后对大鼠死亡率、神经功能损伤及脑组织含水量、血脑屏障通透性损害的影响,并通过尼氏染色、TUNEL检测其对神经细胞损伤的影响,以明确激活腺苷A3受体是否对SAH后早期脑损伤具有保护作用;第二部分则通过荧光定量RT-PCR、ELISA检测了腺苷A3受体激活后SAH大鼠脑组织内主要炎症因子的转录和表达释放,免疫荧光组织化学法观察脑组织皮层及海马区域主要炎症细胞小胶质细胞和星形胶质细胞活化的情况,以观察激活腺苷A3受体是否可以减轻SAH后脑组织炎性损伤,同时为了进一步确定其对炎性反应的影响是直接的干预作用还是通过对神经细胞本身的保护,而导致的炎症反应伴随性减轻,我们采用二氯化钴诱导建立的PC12神经元样细胞化学缺氧损伤模型,观察腺苷A3受体激活对神经细胞本身是否有直接的保护作用;第三部分通过脂多糖LPS诱导BV2小胶质细胞活化模型模拟SAH后小胶质细胞活化的体外模型,通过体外实验,采用流式细胞术、ELISA、激光共聚焦、western blot等方法观察腺苷A3受体激活对小胶质细胞活化的表面标志物CD11b表达、炎性细胞因子释放、相关信号通路的影响三个方面来进一步证实腺苷A3受体对小胶质细胞活化的抑制作用及其分子机制。 材料和方法 整个研究包括在体和离体实验。在体实验建立了SD大鼠蛛网膜下腔出血脑损伤模型,并观察腺苷A3受体特异性激动剂对SAH后早期脑损伤的神经保护作用及脑组织炎症反应水平的影响;离体实验以大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12模拟神经元,培养BV2小胶质细胞,并观察腺苷A3受体激活通过抑制小胶质细胞活化,发挥神经保护作用的效应及具体机制。 1.应用颈内动脉线栓穿刺法建立SD大鼠SAH模型; 2.将SD大鼠分为Sham(假手术组) , SAH(蛛网膜下腔出血组) ,以及Cl-IB-MECA(腺苷A3受体特异性激动剂CL-IB-MECA干预组)三组,分别测定大鼠脑组织含水量、血脑屏障通透性以及死亡率; 3.应用Garcina评分及前肢放置试验检测Sham、SAH及Cl-IB-MECA三组大鼠的神经行为功能;通过尼氏染色、TUNEL检测明确其对神经细胞损伤的影响 4. ELISA法检测SAH后各组大鼠伤后6、12、24h不同时间脑组织炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6以及IL-10的浓度变化; 5.荧光定量RT-PCR检测SAH后各组大鼠伤后不同时间脑组织IL-1β、TNF-α、IL-6以及IL-10的mRNA表达水平; 6.以二氯化钴诱导建立的PC12神经元样细胞化学性缺氧损伤模型,MTT法检测不同浓度腺苷A3受体特异性激动剂及拮抗剂干预后细胞活性损伤程度; 7.建立脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞活化模型,予以不同浓度腺苷A3受体特异性激动剂及拮抗剂作用后,采以流式细胞术观察小胶质细胞活化的表面标志物CD11b表达变化,ELISA法检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6释放含量的变化,应用western blot检测体外培养BV2小胶质细胞内TLR4、p38 MAPK、ERK、以及Akt/IκBα的表达变化;激光共聚焦检测LPS对BV2细胞内NF-κB激活的影响。 结果 1. SD大鼠SAH后死亡率50.00%,与人类蛛网膜下腔出血损伤后死亡率基本相符; 2.腺苷A3受体特异性激动剂Cl-IB-MECA能够有效减轻大鼠实验性蛛网膜下腔出血后神经功能缺损,显著降低大鼠的死亡率。 3. Cl-IB-MECA激活A3受体可以减轻大鼠实验性蛛网膜下腔出血后血脑屏障通透性损害,缓解脑组织水肿程度,对神经元损伤具有保护作用。 4.大鼠实验性蛛网膜下腔出血后脑组织炎症因子表达及释放增加,小胶质细胞和星形胶质细胞活化,是蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的主要病理损害机制之一。腺苷A3受体激活能够显著降低大鼠实验性蛛网膜下腔出血后脑组织炎症因子的表达及释放,抑制小胶质细胞的活化,从而发挥神经保护作用。 5.腺苷A3受体激活对二氯化钴诱导的PC12神经元样细胞缺氧性损伤没有直接的保护作用。 6.成功建立LPS诱导的BV2小胶质细胞活化模型,证明LPS并不影响BV2细胞增殖,但促进NO释放而使细胞活化。 7.腺苷A3受体激活能够抑制小胶质细胞活化表面标志物CD11b的表达,减轻NO及炎症因子的释放,对小胶质细胞数量无显著影响。 8.腺苷A3受体激活抑制小胶质细胞活化后PI3K/Akt/信号通路磷酸化,抑制IkBa降解,进而抑制NF-κB p65核内转位,而对P38/ERK通路磷酸化及TLR4受体表达无显著影响。 结论 1.腺苷A3受体激活能够有效减轻大鼠实验性蛛网膜下腔出血后脑水肿及神经功能缺损,显著降低大鼠的死亡率,对早期脑损伤具有神经保护用。 2.大鼠实验性蛛网膜下腔出血后脑组织炎症因子表达及释放增加,胶质细胞活化,是蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的主要病理损害机制之一; 3.腺苷A3受体激活能够显著降低大鼠实验性蛛网膜下腔出血后脑组织炎症因子的转录及表达释放,抑制小胶质细胞活化,从而发挥神经保护作用。 4.腺苷A3受体激活对小胶质细胞活化具有抑制作用,可能是通过抑制PI3K/Akt/IkBa信号通路,进而抑制NF-κB p65核内转位发挥其抗炎效应,而对P38/ERK通路磷酸化及TLR4受体表达没有影响。


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