肠出血性大肠杆菌EHECO157：H7的分子进化研究

【摘要】：肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157:H7作为一种重要的人畜共患传染病病原菌,其感染具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已成为全球性的公共卫生问题,对人们的健康构成了巨大威胁。此外,EHEC O157菌培养容易、感染力强、传播途径多样,使O157菌极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂;O157菌的烈性致病因子还有可能用于基因武器的构建。美国疾病控制中心已将其列为B类生物恐怖病原体严加防范。因此,无论从公共卫生还是生物反恐的需要出发,加强其流行病学研究对预防和控制O157感染具有重大的战略意义。 病原体在进化的过程中通过自然突变、转导和转化等方式发生遗传物质的改变,而引起性状(毒力、耐药性等)的改变。EHEC O157:H7是由055:H7进化而来的,大多数毒力基因都是在进化过程中获得的,对其引起人类疾病发挥关键的作用;同时毒力基因大多数处于移动性遗传物质上,很容易重新组合产生新的致病菌株,而导致O157感染的暴发流行。因此,从分子水平对EHEC O157:H7的流行病学进行研究,观察其分子变异和进化,可为O157感染的暴发提供预警信号以应对可能出现的流行事件。 本研究在对我国分离获得的EHEC O157:H7菌株进行微生物学、血清学、生化以及分子生物学(16S rRNA)检测等全面鉴定的基础上,采用PCR检测其主要毒力基因(stx1/2、hlyA、tccP)、MLST测定和分析其保守的管家基因(aspc, icdA, uidA,clpX,mdh, fadD ,lysp )核苷酸序列,通过系统生物学和分子进化分析,以研究EHEC O157:H7分子进化和流行规律,为寻找其感染暴发流行的预警信号提供线索和依据。 主要完成了以下工作: 1.对1999~2007年江苏省疾病预防控制中心建立的O157菌株资源库以及2005~2007年重庆市主城区和三峡库区收集的O157菌株库中的105株EHEC O157:H7菌株从分离培养、血清学试验、生化试验、16S rRNA检测等进行了全面鉴定。 2.对上述105株EHEC O157:H7菌株基因组的7个管家基因(aspc, icdA, uidA,clpX,mdh, fadD ,lysp )的核苷酸序列进行了测定,获得了7个ST型分别为ST836、ST837、ST838、ST839、ST840、ST841和ST842。其中ST837、ST840、ST841属于谱系1,ST836、ST838、ST839和ST842属于谱系2。 3.对上述105株EHEC O157:H7菌株基因组的毒力基因(stx1/2、hlyA、tccP)进行了PCR检测和分析,结果:所有菌株均检出了stx2基因,stx2的检出率为100%,仅1个菌株(99G144)同时携带stx1和stx2基因, stx1的检出率为0.95%;HlyA在105株的EHEC 0157:H7中检出率是100%;在105株EHEC 0157:H7中共检测出包括3个、4个和5个重复片段三种不同重复片段的tccp基因,其中三个重复片段的有13株(12.4%),4个重复片度的有6株(5.7%),5个重复片段的有86株(82.0%),同时,人源的菌株均为5个重复片段,动物源菌株70%菌株属于5个重复片段。 4.将获得的7个新的ST基因型与EcMLST数据库比对,采用最小进化树和分解树进行溯源分析,发现ST836是这105株的来源菌株,与来源于Sakai的ST66联系紧密,而ST66又与源于EDL933的ST69属于同一群,可以认为ST836与ST69、ST66是来源于同一祖先的。初步推测在中国爆发流行的EHEC O157:H7起源可能是由最早爆发的美国EDL933株经日本传播到我国的。 5.对不同分离地点和宿主来源菌株的STs分配频率分析发现:ST842仅来源于人源的,ST838、ST840、ST839这3个STs型仅见于动物源菌株。从菌株的数量来看,ST837的菌株最多,其次是ST836,两者占到85%。 结论: 上述研究工作为建立我国EHEC O157:H7菌株基因信息库奠定了一定的基础,同时为研究我国EHEC O157:H7的分子进化和流行规律、寻找其感染暴发流行的预警信号提供了有利的线索和依据。