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PKC-ζ活化在SDF-1趋化人表皮干细胞迁移中作用的初步研究

郭锐  
【摘要】:各种战创伤会造成机体体表损伤和器官功能损害,使机体内环境紊乱、感染、出血、疼痛等,甚至休克死亡。在变化不定的外环境中,人体最大的器官皮肤能够有效抵御有害物质入侵,保持机体内环境相对稳定,维持机体各种正常功能。机体体表受损时,尽快覆盖创面和加速创面愈合有助于机体免于脱水、损伤和进一步感染。皮肤创面愈合是多种细胞、细胞因子及细胞外基质共同参与的复杂过程。一般分为三个阶段:1、炎性反应阶段。2、细胞迁移增殖,肉芽组织形成阶段。3、创面重塑改建阶段。研究创面愈合过程的机理一直以来是战创伤研究的热点。 在促进创面愈合的研究中,表皮干细胞(epidermal stem cell,ESC)日益受到人们的重视。表皮干细胞是位于皮肤表皮基底层,具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的一类细胞。数量约占表皮基底层的1%~10%。是皮肤发生、修复、改建的主要功能细胞。它维持皮肤新陈代谢,在创伤形成后,它会代偿性增殖和定向分化来参与损伤修复。表皮干细胞从创缘向创面中心增殖分化覆盖创面的过程就是创伤后的创面上皮化过程。创面上皮化在创面愈合中尤为重要。更好更快的促进表皮干细胞实现功能是加快创面愈合的关键。 干细胞实现功能从原位进入到靶位迁移运动的过程受趋化因子/趋化因子受体系统调控。间质细胞衍生因子(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)和其特异性受体趋化因子亚家族CXC成员CXCR4共同组成SDF-1/CXCR4轴,广泛表达于多种组织细胞中,参与胚胎造血迁移、胚胎发育、造血生成、组织再生重塑、肿瘤细胞转移及创面愈合等一系列生理、病理过程的调节。我们前期研究发现趋化因子SDF-1的特异性受体CXCR4在表皮细胞表达,并且在越靠近表皮基底膜部位细胞胞膜表达水平越高,在急性创伤伤口及创缘部位的SDF-1分泌量较慢性创面明显增多,SDF-1在受损组织部位的基因和蛋白表达比正常皮肤组织高。对三维皮肤等价物全层皮肤创面模型观察发现,创缘部位SDF-1的量增多时,创缘基底层β1整合素表达阳性的细胞数量增多且向表层迁移积聚,说明SDF-1通过作用受体CXCR4趋化表皮干细胞向创缘迁移,参与创面的修复。但是SDF-1通过作用CXCR4趋化ESC迁移的信号通路及调控机制仍不十分明确。 研究发现,蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)能够上调SDF-1的表达。PKC是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。包含有三个亚家族:cPKC (classical PKC,包括α、β1、β2、γ亚类);nPKC (novel PKC,包括δ、ε、η、θ亚类);aPKC( atypical PKC,包括ι/λ、ζ亚类)。PKC信号转导通路是细胞内重要信号通路,PKC作为重要的信号转导分子,具有广泛的生物学效应。PKC通过催化丝氨酸/苏氨酸蛋白质底物磷酸化,转导细胞信号,在细胞信号作用下调节细胞代谢、生长、增殖、分化、凋亡和迁移运动。 不同的PKC亚型的结构功能是不同的。研究表明,在内皮细胞的迁移运动中PKC-α的表达水平增高。PKC-α被发现与结肠癌细胞和乳腺癌细胞的迁移启动有关。PKC-β、PKC-δ、PKC-θ、PKC-ζ与细胞迁移运动有关。PKC-ζ在SDF-1趋化人CD34+祖细胞、人间充质干细胞运动中起调节作用。在趋化因子趋化分叶核白细胞的粘附和肌动蛋白聚合中也有PKC-ζ的参与。抑制PKC-ζ的活性会使骨髓间充质干细胞SDF-1表达降低,迁移运动能力减弱。目前,对于趋化因子SDF-1与其受体CXCR4结合后,趋化表皮干细胞迁移运动的信号通路机制研究依旧不清楚。研究PKC-ζ是否会在SDF-1趋化人表皮干细胞迁移运动的信号传导中起作用,它的活性会如何变化,是否影响SDF-1趋化人表皮干细胞的细胞骨架变化,是本研究的研究重点。本研究主要目的、方法、结果和结论如下: 一、目的 初步探讨在趋化因子SDF-1与其受体CXCR4结合趋化表皮干细胞迁移运动中信号蛋白PKC-ζ的作用及其可能的机制,为进一步研究趋化因子SDF-1趋化表皮干细胞迁移运动信号通路,调控表皮干细胞迁移,促进创面愈合提供思路。 二、方法 1.从正常人包皮组织中消化分离得到表皮细胞,用人胎盘IV型胶原快速粘附法分选人表皮干细胞,在DK-SFM培养基中培养。对体外培养的细胞进行形态学观察,免疫化学染色检测表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白K19。 2.Transwell实验分析不同PKC亚型抑制剂Staurosporine、Chelerythrine chloride和PS-ζ对SDF-1趋化人表皮干细胞迁移运动的影响。 3.Western blot实验检测SDF-1对人表皮干细胞作用后不同时间PKC-ζ磷酸化水平。 4.激光共聚焦成像观察PKC-ζ抑制剂PS-ζ对SDF-1趋化人表皮干细胞极化形态影响,流式细胞仪检测细胞骨架蛋白荧光强度变化。 三、结果 1.对体外分离培养的细胞进行形态学观察,符合人表皮干细胞形态特点。免疫化学染色发现人表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白K19在细胞质中呈棕黄色的阳性表达。 2.趋化运动分析显示,空白对照组的趋化指数0.89±0.11,阳性对照组的趋化指数11.39±0.38, 3个PKC亚型抑制剂Staurosporine、Chelerythrine chloride、PS-ζ处理组的趋化指数分别是9.88±0.26、0.67±0.11、1.44±0.17,其中PS-ζ处理组和阳性对照组之间差异显著(P0.05),和空白对照组之间差异不显著(P0.05)。 3.SDF-1对人表皮干细胞作用后不同时间PKC-ζ磷酸化水平,在没有任何处理时,即在0min时,人表皮干细胞内无明显PKC-ζ活化(即PKC-ζ的磷酸化);而SDF-1作用表皮干细胞1min后,人表皮干细胞内p-PKC-ζ表达水平升高。 4.用激光共聚焦显微镜对具有代表性的细胞极化形态现象照相,阳性对照组的细胞在SDF-1的作用下,相对于阴性对照组的细胞,呈现迁移运动状,伸出片层状伪足。而用PKC-ζ的特异性抑制物PS-ζ处理后的人表皮干细胞,同阴性对照组细胞相比较,细胞骨架变化不明显,未见伪足伸出;用流式细胞仪对人表皮干细胞的细胞骨架蛋白荧光强度进行了检测,发现阳性对照组的细胞在SDF-1的作用后,细胞骨架荧光强度增高,均高于阴性对照组的细胞,而用PKC-ζ的特异性抑制物PS-ζ处理后的人表皮干细胞,即处理组细胞,在SDF-1的作用后,细胞骨架荧光强度并未出现同阳性对照组相似的增高情况,同阴性对照组细胞相比较,细胞荧光强度变化不明显。 四、结论 1.体外成功分离、培养出了人表皮干细胞。表皮干细胞的表面标志物β1整合素和角蛋白K19免疫细胞化学染色呈棕黄色着色的阳性表达。说明体外分离培养出细胞符合人表皮干细胞鉴定特征。 2.特异性的抑制PKC-ζ使趋化因子SDF-1对人表皮干细胞的趋化活性显著降低。 3.趋化因子SDF-1作用人表皮干细胞后p-PKC-ζ蛋白表达明显增高。 4.特异性的抑制PKC-ζ能够抑制趋化因子SDF-1对人表皮干细胞骨架影响,降低人表皮干细胞肌动蛋白荧光强度。


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