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应用MLVA对中国人群幽门螺杆菌的基因分型研究

郭春亮  
【摘要】:目的: 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H. pylori)是一种螺旋状、微需氧、革兰阴性杆菌,定植于人胃黏膜表面。全球约有50%的人口感染H. pylori,尤其在发展中国家,其感染率达50%~70%。 人类是H. pylori唯一的天然宿主,大量研究表明H. pylori感染与慢性胃炎、消化性溃疡和胃黏膜相关组织淋巴瘤(MALT)的发生密切相关。人类对H. pylori普遍易感,但感染后的症状轻重缓急各不相同,表现出明显的致病性差异,轻者可无症状长期携带,重者可引起慢性胃炎、胃十二指肠溃疡甚至肿瘤。其原因不仅与宿主的遗传易感性相关可能更与菌株的毒力强弱相关。 H. pylori有其独特的遗传变异性和种内多样性,等位基因的序列多态性远远高于其它细菌。目前对H. pylori进行的基因分型主要依据几种与其感染密切相关的蛋白质或管家基因的多态性,然而这些传统分型方法都存在着各自的局限性,目前对于H. pylori的分型方法还没有一个公认的金标准。 利用基因组中特定位点上可变数目串联重复序列(variable number tandem repeat sequence,VNTR)进行基因分型是生物中常用的方法。VNTR位点是细菌基因组中的串联重复序列,重复序列在不同菌株间重复次数不同,而重复序列的大小及两侧的序列高度保守。因此可通过比较VNTR位点重复次数的数目来区分不同的菌株。多个VNTR位点的基因分型称为多位点串联重复单元基因分型方法即Multi-VNTR (Multi-locus variable-number tandem-repeats analysis, MLVA)。 MLVA具有很高的分辨能力,既可用于流行病学研究,也可用于分子进化学研究,已广泛应用于多种细菌的基因分型研究中,然而尚未在H. pylori中得到应用。本研究首先分离培养中国主要地区与民族的H. pylori,然后采用MLVA对不同来源的幽门螺杆菌菌株进行基因型检测与分析,研究MLVA在幽门螺杆菌基因分型中的应用和MLVA基因型与菌株分离来源的地区、民族、疾病等之间的相关性。 方法: 1.对H. pylori的常规分离培养方法根据高原地区高海拔、低气压、低氧含量等环境特点(西藏拉萨)进行改进,并将改进的分离培养方法(减量法:打开一袋产气袋(约18克)去除7克后置37℃微需氧环境进行培养;加氧法:向培养盒内加入0.224升氧气以补足高原缺氧量,然后,置37℃微需氧环境进行培养;加压加氧法:加氧法操作后,将盒盖顶端的充气阀与1.01×105KPa的氮气阀相联,气流稳定后关闭气阀,置37℃微需氧环境进行培养。)与常规法(将接种过的培养基放入2.5L培养盒内,打开一袋微需氧产气袋立即放入盒内,置37℃微需氧环境培养2~5天。)进行比较。探讨适合高原环境特点的H. pylori分离培养方法,收集高原地区的菌株。同时用常规法收集其它7个不同地区(北京、重庆、上海、内蒙、杭州、石家庄、广州等)、不同病种(胃癌、消化性溃疡、慢性胃炎和无症状携带者)及主要民族(藏族、蒙族、和汉族)的H. pylori菌株。 2.参照其它细菌如结核分枝杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、布鲁氏杆菌等MLVA基因分型的选点原则及H. pylori基因组自身的特点制定了选点原则如下:①重复序列的重复片段≥10bp;②连续两个重复片段的碱基突变率≤5%;③每个重复位点在三株参照株之间(26695, H. pyloriAG1, J99)至少存在两个等位基因。按照此选点原则筛选VNTR位点并设计引物,对不同地区来源的20株H. pylori进行基因扩增,电泳图谱分析,观察扩增条带是否存在差异以及差异程度的大小,进一步筛选具有较好分辨力的VNTR位点。 3.应用筛选的VNTR位点对不同地区、不同消化系疾病、不同民族来源的202株H. pylori菌株进行基因扩增、电泳,应用UVB-紫外凝胶分析仪或Bio-Numerics 5.1分析软件,读出各个扩增片段的大小,根据设计引物时两端保守序列的大小,每个重复单元的长度计算出各个重复片段的重复次数。应用Bio-Numberics软件对重复次数数据进行聚类分析和最小生成树分析,研究MLVA基因型与菌株来源的地区、民族、疾病之间的相关性。 结果: 1.建立了适合高海拔、低气压、低氧含量等环境特点的H. pylori分离培养方法,收集了35株高原地区(西藏)的H. pylori菌株。应用H. pylori的常规分离培养方法收集了广东和石家庄地区H. pylori菌株各12株,北京菌株10株,杭州菌株26株,上海菌株10株,内蒙菌株43株。与日本东京大学交换了15株日本H. pylori菌株,共计实验菌株202株。 2.根据制定的选点原则筛选出了20个VNTR位点,通过预实验进一步鉴定出12个多态性较好的位点,分别为VNTR-180,VNTR-263,VNTR-614,VNTR-557,VNTR-607,VNTR-1801,VNTR-2181,VNTR-2457,VNTR-2576,VNTR-5062,VNTR-5282,VNTR-5581。 3.应用12个VNTR位点对202株H. pylori临床分离株进行了基因分型,取得了较好的分型效果,202株菌株可以完全被鉴别。应用Bio-Numberics软件对重复次数数据进行聚类分析和最小生成树分析,聚类分析结果显示,202株菌株聚集成5个基因亚型,同一个地区来源的菌株表现出了相同或相似的基因型,并聚类在一起,表明了来自同一个地区的菌株具有明显的地区聚集性。对118株4个不同民族(藏族、蒙族、汉族、大和民族)菌株的VNTR位点数据进行了最小生成树分析,结果表明,不同来源的菌株在民族间具有明显的聚集趋势,四个民族来源的菌株主要聚集成了4个亚群,每个民族主要聚集于一个亚群。 4.在202株H.pylori临床菌株中,非溃疡性消化不良、慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃癌菌株分别占14.9%, 55.9%, 25.2%和4.0%,在基因型与疾病的相关性研究中,未发现与疾病的明显相关性。 结论: 1.建立了适合高原环境H. pylori的分离培养方法(减量法、加氧法、加压加氧法)。 2.首次应用MLVA对H. pylori进行了研究,实验表明,MLVA可以对H. pylori进行很好的基因分型。 3. MLVA基因型与菌株分离来源的地域、民族密切相关,与菌株来源患者的疾病未见相关性。


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