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桑葚花色苷的提取及其抗乳腺癌作用研究

王湛  
【摘要】:桑葚又称桑果、桑枣,为桑科落叶乔木桑树的成熟果穗,味甘性寒,酸甜汁多,是人们常食的水果之一。传统中医认为桑葚既可入食,又可入药,味甘酸,性微寒,入心、肝、肾,为滋补强壮、养心益智佳果。现代营养医学研究表明,桑葚具有增强免疫功能,促进造血细胞的生长,预防动脉粥样硬化,促进新陈代谢等作用,具有一定的药理学价值。 桑葚具备药理活性的基础在于其独特的食物成分,特别是某些生物活性物质。研究表明,成熟桑葚含有丰富的花色苷化合物,膳食花色苷是一类广泛存在于蔬菜、水果等食物中的天然色素,属植物化学素中的黄酮类化合物,流行病学调查和实验研究证实,膳食花色苷化合物具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等广泛、优良的生物学效应,特别是其抗肿瘤活性以天然、低毒、高效而备受关注。由此可以推测,桑葚的药理学活性可能在于其含有丰富的花色苷化合物,但相关研究尚未见报道,因此提取和纯化桑葚花色苷化合物,并研究其药理活性及相关作用机制,对于揭示桑葚的药理活性本质及进一步开发利用桑葚资源均具有一定的意义和价值。 乳腺癌是严重危害妇女健康的常见恶性肿瘤,是引起妇女死亡的常见肿瘤之一,近年来发病率呈上升趋势且趋向年轻化,如何有效防治乳腺癌,特别是通过日常膳食途径防治乳腺癌,已成为国内外营养学领域一个重要研究方向。本课题研究了桑葚花色苷的提取和纯化工艺,并对提取和纯化过程中的各项重要参数进行了优化,获得了桑葚花色苷提取和纯化的最佳方案,由此得到较高含量的花色苷提取物;在此基础上,本课题探讨了桑葚花色苷提取物的抗乳腺癌效应,通过体外细胞增殖检测、凋亡流式分析、线粒体膜电位的激光共聚焦扫描显微镜观察等实验,以及体内乳腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤实验,研究和评价了桑葚花色苷提取物的体内外抗乳腺癌效应,并对可能的作用机制进行初步的探讨。本课题对于探讨通过膳食途径防治乳腺癌以及开发利用桑葚资源均具有一定的科学意义。 本课题研究结果和结论如下: 1.确定了超声辅助乙醇萃取法提取桑葚花色苷和大孔树脂吸附纯化的工艺流程。提取工艺:成熟天然桑葚经洗涤、打碎、冷冻干燥,得到冷冻桑葚干粉;将桑葚干粉溶于酸化乙醇溶液中,超声辅助提取,提取液以5000 rpm离心10 min,取上清液;离心后提取液进行真空抽滤,滤液用旋转蒸发器旋蒸除去乙醇,再用石油醚萃取3次除去脂类,最后利用真空抽滤,得到桑葚花色苷粗提物水溶液。将此溶液冷冻于-70°C冰箱,冷冻2 h后放入冷冻干燥机冷冻干燥为提取物干粉。以Amberlite? XAD7HP型大孔吸附树脂对桑葚花色苷提取物进行纯化,并对提取和纯化过程中的重要参数进行了优化。确定了提取液乙醇浓度为70%和pH值为3.0,料液比为1:20,提取时间为80 min,纯化过程中进液流速为2.0 ml/min,洗脱流速为1.0 ml/min。利用以上提取和纯化方法及参数,最终获得桑葚花色苷提取物其花色苷总含量为(41.8±4.8)%,产品获得率为(2.6±0.7)%。 2.以前期获得的桑葚花色苷提取物作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-453和MCF-7,细胞生长状态及形态观察可见,100、150和200 mg/ml桑葚花色苷作用可产生显著影响,表现为三种乳腺癌细胞的生长密度明显稀疏,细胞排列紊乱,形态异常,大量细胞结构出现缺损,细胞皱缩变圆,或出现肿胀,或胞质凝缩,众多细胞与其周边细胞分离,贴壁性下降,甚至离开瓶壁漂浮到培养基中,出现大量漂浮细胞和细胞碎片,表明桑葚花色苷提取物作用可显著影响三种乳腺癌细胞的生长和形态。CCK-8法细胞增殖活力检测结果表明,100、150和200 mg/ml桑葚花色苷提取物作用可使三种乳腺癌细胞增殖活性显著降低,且随作用浓度的增加降低程度增加,显示出剂量-效应关系,表明桑葚花色苷提取物作用可显著抑制乳腺癌细胞的增殖,显示出较强的体外细胞毒性,具有体外抗乳腺癌效应。 3.以50、100和150 mg/ml桑葚花色苷提取物作用三种乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-453和MCF-7细胞24 h,采用Annexin V/PI双染流式细胞凋亡分析,结果显示,三种乳腺癌细胞凋亡率均升高,显示出促凋亡效应,且具有剂量-效应关系,100和150 mg/ml组凋亡率显著增高,表明桑葚花色苷提取物可诱导乳腺癌细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。利用JC-1探针和激光共聚焦扫描显微镜检测线粒体膜电位,结果显示,桑葚花色苷提取物作用24 h,可使MDA-MB-453细胞线粒体膜电位显著下降,表现为红色/绿色荧光的比值降低,表明桑葚花色苷提取物可降低乳腺癌细胞线粒体膜电位,促发凋亡发生。 4.利用BALB/c裸鼠制造乳腺癌移植瘤动物模型,以50、100和200 mg/kg/d的桑葚花色苷提取物进行膳食干预,观察其体内抑瘤效应。实验结果显示,各组裸鼠饲养期间生长状态良好,至观察终点时,各组间动物体重无显著差异,表明桑葚花色苷提取物膳食处理无明显毒副作用;移植瘤生长观察结果表明,桑葚花色苷提取物膳食干预组移植瘤生长速度低于对照组,处理28 d后,桑葚花色苷提取物干预组移植瘤体积和质量均低于对照组,且随作用剂量增加降低程度增大,显示出剂量-效应关系,100和200 mg/kg/d干预组与对照组相比具有显著性差异,表明桑葚花色苷提取物膳食干预可显著抑制乳腺癌移植瘤的生长,显示出较强的体内抑瘤效应。 综上所述,本课题提出了桑葚花色苷的提取和纯化工艺,并对提取和纯化过程中的各项重要参数进行了优化,获得了桑葚花色苷提取和纯化的最佳方案;在此基础上,通过体外细胞增殖检测、凋亡流式分析、线粒体膜电位的激光共聚焦扫描显微镜观察等实验,以及体内乳腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤实验,证实了桑葚花色苷提取物的体内外抗乳腺癌效应,并初步揭示出其作用机制可能在于通过内源性途径诱导肿瘤细胞凋亡。


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