收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

人牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化过程中miRNAs表达谱筛选及鉴定的实验研究

张萍  
【摘要】:研究背景 牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells, DPSCs)自2000年被澳大利亚学者Gronthos等[1]发现以来,一直是研究的热点,其被定义为存在于牙髓组织中具有高度增殖、自我更新和多向分化的潜能的未分化间充质细胞。但DPSCs由于存在分离纯化难、体外培养易老化、分化调节机制尚不清楚等诸多问题,使得DPSCs的研究进展缓慢。而microRNAs(miRNAs)的发现和基因芯片技术的飞速发展,为DPSCs的研究开辟了新的思路。 miRNAs是存在于真核细胞当中具有进化保守性的一族非编码小片段RNA,为18~24bp大小,通过与靶基因mRNAs的碱基互补配对(以前观点认为miRNAs仅仅和mRNA3’–UTR区完全或不完全配对发挥作用,最新研究显示[2],其也可与mRNAs编码区结合发挥作用)来影响mRNAs的稳定性或抑制其翻译,实现对蛋白表达的调控[3]。miRNAs不仅在细胞分化、增殖等诸多生理过程中发挥作用,如凌宏艳等[4]研究发现3T3-L1前脂肪细胞分化过程中存在miRNAs表达谱的变化,也与多种疾病,特别是肿瘤的发生发展有密切关系。研究表明[5,6],miRNAs在恶性肿瘤的转移和侵袭中担当重要角色,也在血管生成中起到了重要的调节作用。根据DPSCs生理特点,作为机体内源性RNA,miRNAs很可能在DPSCs的生长分化中起到重要的调控作用。 目前采用芯片技术筛选DPSCs向成牙本质细胞分化过程中miRNAs表达谱还少见报道,因此研究miRNAs在DPSCs定向诱导分化过程中的表达情况,对进一步阐明DPSCs的分化机制具有重要意义。 目的 筛选人DPSCs向成牙本质细胞定向分化过程中差异表达的miRNAs并进行初步鉴定。 方法 1、人DPSCs培养与鉴定:采集临床18-25岁因正畸或阻生需要拔除的健康、完整、无龋坏的牙齿,采用酶消化法分离获得并常规原代及传代培养;观察细胞生长状态、形态及其变化;细胞克隆形成率;免疫组化法检测细胞表型;多向分化能力检测。 2、基因芯片筛选成牙本质诱导过程中人DPSCs miRNAs表达谱:4代人DPSCs,传代24h,细胞贴壁,更换为成牙本质诱导性培养液,2-3d换液,进行连续培养;用TRIzol试剂分别提取诱导0d组、7d组、14d组细胞总RNA,利用Affymetrix miRNA芯片进行miRNA芯片杂交。 3、荧光实时定量PCR验证芯片结果。由于miRNAs芯片结果存在一定假阳性率,故对芯片结果中差异显著miRNAs的表达水平应用实时定量PCR或者Nothernblot进行验证。 4、差异显著miRNA靶基因的分析及预测:使用ClusterTreeview软件对芯片结果进行聚类分析。应用miRGen Target和TargetScan在线软件对芯片结果中部分差异明显且经Q-RT-PCR验证的miRNAs进行靶基因预测,并结合文献资料查找与牙髓干细胞向成牙本质细胞分化相关的靶基因。 结果 1、连续培养的人DPSCs增殖快,细胞呈集落状生长,克隆形成率为5-32个/104细胞;免疫组化法检测显示细胞有vimentin、Ⅰ型胶原、GFAP和nestin的表达;成脂诱导3w细胞内有油红O染色阳性脂滴形成;成牙本质定向诱导14天后,细胞经茜素红染色,表达矿化结节。 2、miRNAs表达谱芯片结果显示人DPSCs在向成牙本质细胞分化过程中一共有6条miRNAs表达发生了2倍以上的改变,其中上调miRNAs为hsa-miR-633_st,hsa-miR-559_st,hsa-miR-122-star_st,下调miRNAs为hsa-miR-210_st,hsa-miR-1246_st,hsa-miR-31_st。 3、荧光定量RT-PCR结果显示hsa-miR-633显著上调,hsa-miR-210显著下调,与芯片结果基本一致,说明本研究芯片获得的结果真实可靠。 4、通过软件预测并结合文献,发现hsa-miR-633的靶基因BMP-2、MEPE和hsa-miR-210的靶基因GIT2与成牙本质分化相关。 结论 1、利用miRNAs表达芯片对人DPSCs分化过程中0d、7d和14d组进行了差异性的筛选,筛选出表达变化差异2倍以上上调miRNAs共3个,下调miRNAs共3个。表明人DPSCs向成牙本质细胞分化过程中miRNAs表达谱存在明显变化。 2、初步预测hsa-miR-633和hsa-miR-210靶基因中有与成牙本质分化相关基因,可作为后续研究靶点。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 熊洁;RNA干预与microRNA[J];国外医学.免疫学分册;2004年05期
2 敬敏;陈小毅;;miRNAs与鼻咽癌研究进展[J];肿瘤防治研究;2010年04期
3 李艳春;文继舫;;miRNAs与肝细胞癌[J];基础医学与临床;2010年12期
4 刘立鹏;郭小芳;田智;粟敏;于潇华;;微小核糖核酸在宫颈癌发病机制中的调节作用[J];实用预防医学;2010年11期
5 闵治超;华立新;;非编码微小核糖核酸和前列腺癌关系的研究进展[J];现代泌尿外科杂志;2011年03期
6 张祖斌;顾振纶;蒋小岗;梁中琴;周文轩;郭次仪;;miRNA在肿瘤及肿瘤干细胞中作用的研究进展[J];中国药理学通报;2009年03期
7 汤亚玲;梁新华;陈宇;;miRNAs在涎腺肿瘤中的研究进展[J];口腔颌面外科杂志;2010年01期
8 吴珏;刘芬;汪泱;;miRNA与缺血性疾病中的血管新生[J];基础医学与临床;2011年01期
9 杨桂花;王芳;张俊武;;microRNAs在血液细胞分化及相关肿瘤中的作用[J];中国医学科学院学报;2007年03期
10 杨建军;马延磊;秦环龙;;MicroRNAs作为大肠癌生物标志物的研究进展[J];世界华人消化杂志;2010年06期
11 梅洋;;miRNAs作为调控因子调控基因表达变化[J];职业卫生与应急救援;2010年02期
12 徐竞鸥;欧和生;;MicroRNAs在心血管疾病中作用的研究进展[J];国际病理科学与临床杂志;2009年05期
13 CMBE译文组;探索小RNA的功能[J];现代临床医学生物工程学杂志;2004年03期
14 廖荣霞;孙建国;张亮;陈敏;陈彬;娄桂予;周度金;陈正堂;;乳腺癌miRNAs表达谱检测及初步分析[J];第三军医大学学报;2006年22期
15 尹凤媛;;RNAi在基因治疗中的应用[J];临床血液学杂志(输血与检验版);2009年04期
16 张志平;吴建新;;MicroRNA与胚胎神经发育[J];现代生物医学进展;2010年13期
17 孙建国;廖荣霞;周度金;陈正堂;;基于基因芯片的乳腺癌干细胞miRNAs检测分析[J];重庆医学;2007年13期
18 峗淑莉;张世能;;肿瘤干细胞与肿瘤靶向治疗[J];基础医学与临床;2008年09期
19 陈晓悦;万小平;;MicroRNAs在子宫内膜癌的研究进展[J];现代妇产科进展;2009年08期
20 邱钧;金俊余;孙建国;廖荣霞;王欣欣;陈正堂;;实时定量PCR检测miR-373*、miR-200c在乳腺癌干细胞中的表达及其靶基因预测[J];第三军医大学学报;2011年10期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 ;Computational Prediction and Experimental Verification of miRNAs in Panicum milaceum L[A];植物分子生物学与现代农业——全国植物生物学研讨会论文摘要集[C];2010年
2 陈新建;杨艳会;许海霞;范华敏;李娟;张重义;;正茬与重茬地黄miRNAs的差异表达谱分析[A];全国第9届天然药物资源学术研讨会论文集[C];2010年
3 ;Expression profile of miRNAs in Populus cathayana and Salix matsudana Koidz under salt stress[A];第六届中国植物逆境生理学与分子生物学学术研讨会论文摘要汇编[C];2010年
4 杜江峰;方晓峰;陶士珩;武永军;;生物信息法预测高粱miRNA及其靶基因[A];第六届中国植物逆境生理学与分子生物学学术研讨会论文摘要汇编[C];2010年
5 王小粟;童永鳌;王胜华;;Rapid and Accurate Detection of Plant miRNAs by Liquid Northern Hybridization[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
6 黄勇;唐顺明;王力刚;沈兴家;;家蚕microRNAs的生物信息学预测及其表达特性分析[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(1)[C];2009年
7 ;Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[A];2011医学科学前沿论坛第十二届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2011年
8 ;Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[A];2011医学科学前沿论坛第十二届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2011年
9 ;Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年
10 常徽;谢艳;舒芙蓉;赵长君;糜漫天;;3,6-二羟黄酮对乳腺癌细胞MDA-MB-453移植瘤生长和miRNAs表达谱的影响[A];重庆市营养学会学术会议论文汇编[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 牛文洋;肝细胞癌血清特异miRNAs的筛选及其在诊断中的应用[D];第二军医大学;2011年
2 于鹏;miRNAs对骨髓间充质干细胞分化的影响[D];北京协和医学院;2013年
3 林先滋;奶山羊乳腺组织乳脂代谢相关miRNAs的筛选及功能验证[D];西北农林科技大学;2013年
4 吴绍华;不同倍性水稻miRNAs及其靶基因的鉴定与表达分析[D];四川农业大学;2011年
5 蔡辉;早期胃癌血清miRNAs筛选及其表达研究[D];兰州大学;2013年
6 张志平;神经管畸形与正常胚胎脑组织miRNAs差异表达分析及其靶mRNA的功能预测[D];中国协和医科大学;2010年
7 郭玲;UVB相关的miRNAs的筛选及其功能的初步研究[D];南方医科大学;2010年
8 胡凯;癫痫大鼠海马miRNAs表达谱和miR-34a与-9在癫痫发生中动态变化的研究[D];中南大学;2012年
9 桂俊豪;循环microRNAs作为潜在的肝脏相关疾病标记物的初步研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
10 戴楠;双功能基因APE1与miRNAs相互调控介导骨肉瘤放疗敏感性的机制研究[D];第三军医大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张萍;人牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化过程中miRNAs表达谱筛选及鉴定的实验研究[D];第三军医大学;2011年
2 区丹敏;内毒素血症小鼠肺组织中miRNAs的表达变化及功能的初步研究[D];中南大学;2012年
3 韩冰;相关高血压性脑出血miRNAs基因标记物的研究[D];河北大学;2013年
4 南文智;利用高通量测序技术鉴定棉纤维发育相关miRNAs及其靶基因[D];西北农林科技大学;2013年
5 朱美娟;视网膜神经节细胞放射损伤后miRNAs的差异表达及靶基因预测[D];浙江大学;2013年
6 母治平;猪体内食物源性植物miRNAs的鉴定[D];四川农业大学;2013年
7 黄潘;鸡胚性分化早期性别差异表达miRNAs的鉴定及其特性分析[D];华中农业大学;2010年
8 张丽洁;胎儿与成人主要器官miRNAs的表达量分析[D];华中科技大学;2011年
9 罗阳;儿童肾病综合征血清和尿液miRNAs的研究[D];南京大学;2013年
10 田甜;miRNAs基因区域多态与肺癌易感性及预后关系的分子流行病学研究[D];南京医科大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 刘霞;美用miRNAs制造出诱导多功能干细胞[N];科技日报;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978