人牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化过程中miRNAs表达谱筛选及鉴定的实验研究

【摘要】：研究背景 牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells, DPSCs)自2000年被澳大利亚学者Gronthos等[1]发现以来,一直是研究的热点,其被定义为存在于牙髓组织中具有高度增殖、自我更新和多向分化的潜能的未分化间充质细胞。但DPSCs由于存在分离纯化难、体外培养易老化、分化调节机制尚不清楚等诸多问题,使得DPSCs的研究进展缓慢。而microRNAs(miRNAs)的发现和基因芯片技术的飞速发展,为DPSCs的研究开辟了新的思路。 miRNAs是存在于真核细胞当中具有进化保守性的一族非编码小片段RNA,为18～24bp大小,通过与靶基因mRNAs的碱基互补配对(以前观点认为miRNAs仅仅和mRNA3’–UTR区完全或不完全配对发挥作用,最新研究显示[2],其也可与mRNAs编码区结合发挥作用)来影响mRNAs的稳定性或抑制其翻译,实现对蛋白表达的调控[3]。miRNAs不仅在细胞分化、增殖等诸多生理过程中发挥作用,如凌宏艳等[4]研究发现3T3-L1前脂肪细胞分化过程中存在miRNAs表达谱的变化,也与多种疾病,特别是肿瘤的发生发展有密切关系。研究表明[5,6],miRNAs在恶性肿瘤的转移和侵袭中担当重要角色,也在血管生成中起到了重要的调节作用。根据DPSCs生理特点,作为机体内源性RNA,miRNAs很可能在DPSCs的生长分化中起到重要的调控作用。 目前采用芯片技术筛选DPSCs向成牙本质细胞分化过程中miRNAs表达谱还少见报道,因此研究miRNAs在DPSCs定向诱导分化过程中的表达情况,对进一步阐明DPSCs的分化机制具有重要意义。 目的 筛选人DPSCs向成牙本质细胞定向分化过程中差异表达的miRNAs并进行初步鉴定。 方法 1、人DPSCs培养与鉴定:采集临床18-25岁因正畸或阻生需要拔除的健康、完整、无龋坏的牙齿,采用酶消化法分离获得并常规原代及传代培养;观察细胞生长状态、形态及其变化;细胞克隆形成率;免疫组化法检测细胞表型;多向分化能力检测。 2、基因芯片筛选成牙本质诱导过程中人DPSCs miRNAs表达谱:4代人DPSCs,传代24h,细胞贴壁,更换为成牙本质诱导性培养液,2-3d换液,进行连续培养;用TRIzol试剂分别提取诱导0d组、7d组、14d组细胞总RNA,利用Affymetrix miRNA芯片进行miRNA芯片杂交。 3、荧光实时定量PCR验证芯片结果。由于miRNAs芯片结果存在一定假阳性率,故对芯片结果中差异显著miRNAs的表达水平应用实时定量PCR或者Nothernblot进行验证。 4、差异显著miRNA靶基因的分析及预测:使用ClusterTreeview软件对芯片结果进行聚类分析。应用miRGen Target和TargetScan在线软件对芯片结果中部分差异明显且经Q-RT-PCR验证的miRNAs进行靶基因预测,并结合文献资料查找与牙髓干细胞向成牙本质细胞分化相关的靶基因。 结果 1、连续培养的人DPSCs增殖快,细胞呈集落状生长,克隆形成率为5-32个/104细胞;免疫组化法检测显示细胞有vimentin、Ⅰ型胶原、GFAP和nestin的表达;成脂诱导3w细胞内有油红O染色阳性脂滴形成;成牙本质定向诱导14天后,细胞经茜素红染色,表达矿化结节。 2、miRNAs表达谱芯片结果显示人DPSCs在向成牙本质细胞分化过程中一共有6条miRNAs表达发生了2倍以上的改变,其中上调miRNAs为hsa-miR-633_st,hsa-miR-559_st,hsa-miR-122-star_st,下调miRNAs为hsa-miR-210_st,hsa-miR-1246_st,hsa-miR-31_st。 3、荧光定量RT-PCR结果显示hsa-miR-633显著上调,hsa-miR-210显著下调,与芯片结果基本一致,说明本研究芯片获得的结果真实可靠。 4、通过软件预测并结合文献,发现hsa-miR-633的靶基因BMP-2、MEPE和hsa-miR-210的靶基因GIT2与成牙本质分化相关。 结论 1、利用miRNAs表达芯片对人DPSCs分化过程中0d、7d和14d组进行了差异性的筛选,筛选出表达变化差异2倍以上上调miRNAs共3个,下调miRNAs共3个。表明人DPSCs向成牙本质细胞分化过程中miRNAs表达谱存在明显变化。 2、初步预测hsa-miR-633和hsa-miR-210靶基因中有与成牙本质分化相关基因,可作为后续研究靶点。