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锌转运体8多克隆抗体的制备及功能初步研究

刘宝英  
【摘要】:一、背景 糖尿病以胰岛素分泌的绝对缺乏或外周组织对胰岛素的敏感性降低为特点。来自于基因和环境的危险因素在糖尿病的发病过程中起了重要作用。自从1934年发现锌是胰岛素晶体的组成成分以来,锌与糖尿病间关系的研究备受关注。许多研究试图通过阐明锌在糖尿病中的作用,以进一步揭示糖尿病的发病机制并开发新的治疗药物。在人体各种组织器官中,胰岛中锌的含量最高,并且有研究证实胰岛中锌含量减少与糖尿病的发病密切相关。 既往研究表明,有两个家族参与细胞内锌水平的调节。一个是ZnT(锌转运体)家族,由基因SLC30A编码,它通过使胞浆内的锌出胞或进入细胞器而降低胞浆内锌的浓度。另一个是ZIP(锌结合蛋白)家族,由基因SLC39A编码,它的作用是使细胞外的锌进入胞内或者使细胞器中的锌转移到胞浆而提高胞浆中锌浓度。到目前为止,已经发现10个ZnT家族成员和15个ZIP家族成员。 锌转运体8(zinc transporter 8,ZnT8)是ZnT家族成员之一,它被认为是胰岛β细胞特异的锌转运体。近期的研究表明ZnT8还表达于脂肪组织、外周血淋巴细胞、甲状腺及肾上腺。多个研究表明ZnT8的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)rs132266634与2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)关联。此SNP rs132266634的危险碱基与静脉糖耐量试验中胰岛素分泌减少关联;与胰岛素原向胰岛素的转化过程障碍关联;与空腹血糖的升高关联。因此,ZnT8可作为T2DM的基因标志。 除此之外,近来有研究发现ZnT8也是1型糖尿病的自身抗原之一。有关于ZnT8的SNPrs132266634与1型糖尿病关联的报道。进一步的研究证实利用shRNA下调胰岛β细胞中ZnT8的表达后,β细胞中胰岛素的含量降低并且葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion, GSIS)减少。此外ZnT8基因敲除小鼠表现为血浆胰岛素降低及GSIS减少,而过表达ZnT8的INS-1(胰岛素瘤细胞系)细胞中GSIS增加。 先前的研究表明ZnT8可能是调节胰岛素分泌的一个关键因子,并且可能成为治疗糖尿病的药物靶标。除胰腺之外,脂肪组织是另一个表达ZnT8的组织。脂肪组织中瘦素的表达随着其中锌含量的增加而增加,反之亦然。瘦素是脂肪细胞分泌的一种激素,它在机体摄食和能量代谢的调节中发挥了重要作用。 胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1, GLP-1)具有促胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、刺激胰岛β细胞的增殖和分化、抑制β细胞凋亡、抑制胃排空等作用,近年来成为治疗糖尿病药物研究中的热点。Magnusson N等的研究表明GLP-1可以上调INS-1细胞中ZnT8 mRNA的表达,但GLP-1在体内如何影响ZnT8表达仍不明了。天然的GLP-1在体内很快被二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidylpeptidaseⅣ,DPP-Ⅳ)降解,它的半衰期只有几分钟。Exendin-4是GLP-1类似物,它在体内稳定性较好,通过与GLP-1受体结合而发挥降血糖作用。 目前ZnT8在T2DM胰腺和脂肪组织中的表达情况如何还没有报道。ZnT8在T2DM发病过程中发挥何等作用等还有待进一步研究。 二、目的 本研究的目的在于探讨ZnT8在T2DM中的作用,及其可能的作用机制。利用分子克隆技术构建ZnT8原核表达载体,对ZnT8蛋白进行原核表达及纯化。以所纯化的蛋白免疫新西兰兔得到ZnT8多克隆抗体,并对抗体进行纯化。选择db/db小鼠(T2DM模型小鼠)作为研究对象,从mRNA水平及蛋白水平检测ZnT8在胰腺和脂肪组织的表达情况。同时选择Exendin-4进行干预(db/db小鼠腹腔注射Exendin-4),观察干预后ZnT8在胰腺和脂肪组织中表达的变化。 三、方法 1.依据ZnT8羧基端(ZnT8-C,268-369位氨基酸)基因序列(GenBank NO:NM_173851.2)分别设计带有BamHI和NotI酶切位点的引物,以Chimienti教授惠赠p-ZnT8载体为模板,利用PCR扩增ZnT8-C片段,并克隆至原核表达载体pET32a,经测序正确后,将之转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达、Ni2+-NTA层析纯化,并用His抗体鉴定的,获得纯化ZnT8-C重组蛋白。将纯化的ZnT8-C重组蛋白与弗氏佐剂乳化,将其作为抗原免疫新西兰兔,获得兔抗血清,经饱和硫酸铵纯化,获得初步纯化的兔抗ZnT8多克隆抗体,通过间接ELISA检测多克隆抗体效价,Western blotting及免疫组化方法初步检测其活性。 2.提取db/db小鼠胰腺及脂肪组织的总RNA及总蛋白,应用real-time PCR技术及Western blotting技术从核酸水平及蛋白水平检测ZnT8的表达情况。Exendin-4给药干预后观察db/db小鼠胰腺及脂肪组织中ZnT8的表达情况。 四、结果 1.(1)成功扩增出ZnT8-C的cDNA,经序列比对,与GenBank上登录的编码ZnT8的羧基端cDNA序列完全匹配。(2)成功构建了重组原核表达质粒pET32a-ZnT8-C并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中获得可溶性表达,分子量约30kDa,经Ni2+-NTA层析纯化,Western blotting鉴定为所需ZnT8-C目的蛋白。(3)获得纯化的ZnT8-C重组蛋白,并用其免疫新西兰兔,得到兔抗ZnT8多克隆抗体。以重组蛋白为抗原,用间接ELISA检测ZnT8抗血清的效价在l:3200- l:6400。免疫印迹分析:ZnT8抗血清在分子量约30kd处与相应的原核表达蛋白呈现特异性结合条带,表明所制备的多克隆抗体具有较好的免疫学活性。 2.(1) db/db小鼠胰腺组织中ZnT8的核酸和蛋白表达与杂合子的对照小鼠相比显著降低。db/db小鼠睾丸脂肪和中心脂肪组织中ZnT8的核酸和蛋白表达与对照小鼠相比也显著降低。(2) Exendin-4给药后db/db小鼠胰腺组织中ZnT8的核酸和蛋白表达与对照组相比显著升高,而脂肪组织中ZnT8的核酸和蛋白表达与对照组相比没有显著差异。 五、结论 本研究主要结论: 1.成功制备了具有较好活性的ZnT8多克隆抗体。 2.db/db小鼠胰腺和脂肪组织中ZnT8的表达较对照组降低,提示ZnT8可能参与了T2DM的发病及疾病的进展;Exendin-4给药可使db/db小鼠胰腺组织中ZnT8的表达上调,而对其脂肪组织中ZnT8的表达则没有影响,提示ZnT8可能是GLP-1作用的药物靶点。


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