Fas基因在顺铂诱导的人小细胞肺癌多药耐药中的作用研究

【摘要】：研究背景: 小细胞肺癌在治疗初期对化疗药物很敏感,但往往在治疗后期表现出对药物的耐药。顺铂的细胞毒作用主要是顺铂与核蛋白连接,形成铂类药物与DNA链间或链内交联,以及DNA-蛋白质交联损伤。顺铂是临床上小细胞肺癌化疗常用的药物,然而对于许多患者来说,对顺铂产生的耐药性损害了顺铂的治疗效果。细胞的自我适应是造成肺癌耐药的主要原因:1.细胞膜上转运蛋白(P糖蛋白,多药耐药蛋白,肺耐药相关蛋白等)的增多使得胞吐作用增强,导致细胞内药物浓度下降;2.肿瘤细胞对抗肿瘤药物的解毒作用增强(例如谷氨酰胺转移酶增多);3.化疗药物作用的靶点蛋白发生了变化(如拓扑异构酶Ⅱ的减少)导致肿瘤细胞药物敏感性的下降;4. DNA修复功能得到增强(如ERCC1表达的增加);5.细胞中相关信号传导的不正常表达。凋亡信号传导的异常,例如:促凋亡基因Bax,Fas/FasL表达的下调或者抗凋亡基因Bcl-2表达的上调亦可以导致恶性细胞对化疗药物的抵抗。 Fas是一种分子量为45kDa的Ⅰ型穿膜蛋白,表达在不同种类普通细胞和恶性细胞(包括肺癌细胞)的细胞膜表面。其配体FasL多表达于激活的T细胞和一些恶性细胞细胞膜表面。当细胞外的FasL与细胞膜表面Fas发生三聚反应,Fas关联的死亡结构域(FADD)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8(caspase 8)与胞内Fas的死亡结构域相结合,即可在细胞内诱导产生死亡信号,导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的级联激活并最终导致细胞死亡。由于FasL可以诱导表达Fas的肿瘤细胞凋亡,Fas/FasL系统在T细胞介导的细胞毒作用,肿瘤细胞介导的自分泌性自杀和旁分泌杀伤中扮演重要的角色。从另外一方面来说,肿瘤细胞可以通过下调其自身Fas的表达来避免被杀死。已有文献证明,对顺铂耐药的的肺癌细胞低表达Fas,相应的其凋亡率显著的下降。一些文献将肿瘤的多药耐药性与Fas基因表达的下降和Fas介导的凋亡下降相联系起来。这些文献发现对Fas介导的凋亡不敏感的肿瘤细胞同样对化疗药物也不敏感,这也许是因为由化疗药物诱导的肿瘤细胞死亡途径被打断的缘故。重新上调Fas基因是否能够逆转已对顺铂产生耐药的人类小细胞肺癌细胞的耐药性目前仍不是很清楚。如果上调Fas基因可以逆转已对顺铂耐药的人类小细胞肺癌细胞耐药性,那么其机制是什么,是改变了耐药基因的表达,还是对细胞信号传导产生了影响,这些都需要我们进一步的研究。 研究目的: Fas/FasL系统是凋亡的主要调节者,而在耐药的肿瘤细胞中,Fas基因一般低表达。目前,Fas基因在肿瘤细胞耐药机制中所起的作用尚不清楚,本研究拟上调Fas基因在对顺铂耐药的人小细胞肺癌细胞株(H446/CDDP)上的表达,然后观察H446/CDDP细胞耐药性、凋亡率,以及部分耐药基因和信号传导通路表达的变化情况,初步探索Fas基因在小细胞肺癌耐药机制中所起的作用。 研究方法: 1.通过逐步增加顺铂给药浓度的方法诱导对顺铂耐药的人小细胞肺癌细胞株(H446/CDDP),该细胞株同时也对其他一些化疗药物耐药。 2.构建含Fas基因的腺病毒载体。 3.将携Fas基因的腺病毒载体转染H446/CDDP细胞株。运用CCK-8法检测转染前后细胞对顺铂及其他化疗药物化疗耐药性的变化。 4.运用表达谱基因芯片、RT-PCR和Western blot法检测转染前后P170,MRP,TOPOⅡ,bcl-2,Bax,GST-π,ERCC1以及部分信号通路表达的变化;运用流式法检测转染前后凋亡率的变化。 结果: 1.成功诱导建立了对顺铂耐药的人小细胞肺癌细胞株(H446/CDDP),该细胞株对其他一些化疗药物也具有显著的耐药性(P0.01)。 2.在H446/CDDP细胞株中,基因芯片和RT-PCR检测发现包括一系列耐药和凋亡基因表达的改变,包括MRP、P170、GST-π、ERCC1、TopoⅡ、Bcl-2等耐药和凋亡抑制基因表达的显著上调,而Fas凋亡基因表达的显著下调(P0.01)。 3.在H446/CDDP细胞株中,基因芯片检测发现包括一系列信号通路表达的改变,包括PI3K、PKC、JAK-STAT、ERK和p38MAPK信号通路上调,JNK信号通路下调。 4.成功构建了Fas基因过表达的腺病毒载体,并成功利用携Fas基因的腺病毒载体将Fas基因转染入H446/CDDP细胞中,其可稳定的上调Fas基因在H446/CDDP细胞上的表达。 5.上调Fas基因在H446/CDDP细胞上的表达,可以显著恢复肿瘤细胞对顺铂和其他一些化疗药物的敏感性(P0.01)。 6.上调Fas基因在H446/CDDP细胞上的表达,可以显著增加肿瘤细胞的凋亡率(P0.01)。 7.上调Fas基因在H446/CDDP细胞上的表达,可以在mRNA和蛋白水平显著降低Bax,TopoⅡ,MRP,P170,GST-π和ERCC1的表达,显著增加Fas和bcl-2的表达(P0.01)。 8.基因芯片检测发现上调Fas基因在H446/CDDP细胞上的表达,可以引起PI3K、PKC、JAK-STAT信号通路的抑制,以及JNK和p38MAPK信号通路的激活。 结论: 1. H446/CDDP细胞不但对顺铂具有耐药性,也对其他一些化疗药物具有耐药性,其机制可能是:MRP,P170,GST-π,ERCC1,TopoⅡ等耐药基因表达的上调;凋亡基因Fas表达的下调;PI3K、PKC、JAK-STAT、ERK1/2和p38MAPK信号通路的激活,JNK信号通路的抑制。 2.本实验成功构建了携Fas基因的腺病毒载体,并将其转入对顺铂耐药的人小细胞肺癌细胞株H446/CDDP,建立了稳定高表达Fas基因的人小细胞肺癌细胞系H446/CDDP/Fas。 3. Fas在对顺铂耐药的小细胞肺癌细胞株中过表达可以在一定程度上恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能是:降低了耐药基因MRP,P170,GST-π,TopoⅡ和ERCC1等的表达;上调Fas基因表达;抑制PI3K、PKC、JAK-STAT信号通路激活,激活JNK和p38MAPK信号通路。