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乙型肝炎病毒X蛋白上调共抑制分子B7-H1在肝癌细胞中的表达

吴胜昔  
【摘要】:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)为部分双链环状DNA的嗜肝病毒, HBV感染可致急、慢性肝炎,持续HBV感染同原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的进展密切相关。目前全球有3.5亿HBV慢性携带者,每年约1百万死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化、原发性肝癌。 早期研究认为HBV病毒DNA整合肝细胞基因组可激活癌基因或失活抑癌基因,从而诱发肝癌,但其致癌作用未得到完全证实。对HBV病毒基因组的研究表明,HBV基因组主要翻译4种蛋白,即:HBV多聚酶蛋白(HBP)、表面抗原(HBS)、核心抗原(HBC)及X蛋白(HBx)。一些体内外研究发现, HBx可诱导肝细胞的恶性转化及癌变;实验动物研究也发现X基因的转基因小鼠可诱发肝癌(HCC)的发生。进一步的研究则提示,HBx本身并不具备直接的致癌效应,而是作为反式激活因子并有效地激活胞内的AP-1、AP-2、ATF/CREB、NF-kB、c/EBP、PI-3K及Egr-1等多种效应分子及信号传导途径来诱导肝癌形成。此外HBx与p53蛋白结合后,在蛋白水平使靶细胞中抑癌基因及其产物的功能发生改变;并可通过影响正常的细胞周期,干扰DNA的修复及调节肝细胞增殖、分化和凋亡,在HBV病毒感染及原发性肝细胞癌(HCC)发生、发展中起关键作用。虽然有关HBx在HBV诱发肝癌中的研究取得了一定地进展,但HBx如何诱导HCC的发生,其确切的机制尚未清楚。 共刺激分子是一类细胞膜表面分子,其可为T、B细胞的活化提供辅助信号,从而调节细胞增殖、活化及分化。而缺乏共刺激信号的抗原刺激易引起T细胞的耐受、无反应性和细胞调亡。最近,在共刺激分子与肿瘤相互关系的研究中,人们的注意力集中在了新型的B7家族共刺激分子尤其是B7-H1的身上。B7-H1是近年发现的一种对T细胞的活化及存活起重要调节作用的共刺激分子。对肿瘤的研究发现,B7-H1广泛表达于各种肿瘤细胞并通过B7-H1/PD-1途径诱导肿瘤的免疫逃避,B7-H1引起的效应性细胞凋亡是肿瘤细胞免疫逃避的一种重要机制。近来研究发现B7-H1高表达的肝癌病人比低表达的病人不良预后几率显著增加,提示B7-H1可能是肝癌病人复发的一种新的预测分子。 很明显HBx和B7-H1均参与了肝细胞癌的发病进程,然而它们在肝癌发生过程中是否存在某种联系?德国雷根斯堡大学研究小组证实HBV感染肝细胞后上调B7-H1的表达,而HBx在HBV复制中起重要作用,因此我们提出这种假设:HBx可能通过激活B7-H1信号促进肝癌的形成。为了验证这种假设,首先我们根据adr亚型HBV基因组序列设计扩增HBV x基因的PCR引物,扩增HBV x基因片段,与真核表达载体pcDNA3.1(~+)构建重组子,经双酶切和测序鉴定后命名为pcDNA3.1(~+)/HBx。转染HepG2细胞经抗生素G418筛选后获得稳定表达HBV X蛋白的HepG2细胞系,命名为HBx~+-HepG2细胞,转染空载体pcDNA3.1(~+)的HepG2细胞系命名为HBx--HepG2细胞,并经细胞免疫化学染色、Western-blotting及细胞流式技术分析鉴定HBV x蛋白在细胞中的表达。然后我们利用基因芯片技术,分析HBx转染肝癌细胞株引起的表达谱变化,所用芯片为Operon公司的35k human Genome Array,利用该芯片对HBx~+-HepG2和HBx--HepG2细胞的基因表达谱进行分析后,发现在检测的35000个基因中,其中有98个基因转录显著上调,24个基因转录显著下调。这些差异显著的基因属于不同的类型,不仅包括癌基因及抑癌基因,还有调节细胞周期,转录调节,信号分子,细胞黏附分子及编码骨架蛋白的基因。有趣的是,对基因芯片分析后发现HBx能明显上调肝癌细胞B7-H1基因转录,经实时定量PCR进一步验证,蛋白免疫印迹及流式细胞仪分析表明HBx也促进HepG2细胞B7-H1蛋白的表达。最终确定HBV X蛋白上调了B7-H1在HepG2细胞中的表达。为进一步验证HBV X蛋白对共抑制分子B7-H1表达的上调作用,采用细胞流式技术分析PLC/C4细胞系中共抑制分子B7-H1的表达,同样得到HBV X蛋白的表达上调共抑制分子在PLC细胞的表达的结果,而X基因被干扰的C4细胞B7-H1未上调表达。 那么HBx通过何种机制上调肝癌细胞B7-H1的表达呢?大量实验数据提示转录因子NF-κB在HBx对宿主细胞转录激活中发挥重要作用。HBx通过激活NF-κB途径而诱导细胞上调各种基因的表达,如TNF-α、淋巴毒素α,启动子分析提示B7-H1 5’启动子非编码区有几个NF-κB结合位点,有研究表明NF-κB在亚溶破攻膜复合物C5b-9诱导肾小管上皮细胞上B7-H1的表达及IFN-γ诱导皮肤纤维原细胞上的B7-H1表达中起重要作用。本研究我们也试图确定是否HBx诱导B7-H1的mRNA的转录依赖于NF -κB的作用。我们首先PCR扩增B7-H1 5’启动子非编码区基因片段,并插入到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中构建重组子,经双酶切和测序鉴定后分别命名为p88,p175, p203, p398, p723, p960。将以上重组子分别转染HBx~+-HepG2、HBx--HepG2细胞。荧光素酶活性分析表明与HBx--HepG2细胞相比,转染HBx~+-HepG2细胞48h后B7-H1启动子上游2405bp至175bp区域荧光素酶的活性明显升高。然而转染重组子p88后,荧光素酶的活性显著下降。通过GenomeNet我们分析B7-H1启动子上游175bp内的转录因子结合位点,发现了一个NF-κB基序结合位点。我们突变了B7-H1启动子上游175bp内NF-κB结合位点,并将该突变的重组子转染HBx~+-HepG2细胞。荧光素酶实验结果表明转染含NF-κB突变位点的重组子其B7-H1启动子活性下降约70-80%。此外,我们分别在HBx--HepG、HBx~+-HepG2细胞加入核转录因子NF-κB抑制剂PDTC作用24h后, Western-blot分析B7-H1的表达,结果显示加入PDTC作用24h后HBx~+-HepG2细胞表达B7-H1水平显著下降,以上证实HBx诱导HepG2细胞上B7-H1的表达主要通过NF-κB途径。 大量研究已证实肿瘤细胞表达的B7-H1促进T细胞的凋亡。为分析HBx诱导表达的B7-H1对T细胞凋亡的影响,我们首先从健康人的外周血分离PBMC,采用磁化细胞分离器分离法分离初始T细胞,用相应的CD3、CD28单抗激活初始T细胞,分别将HBx~+-HepG2和HBx--HepG2细胞与活化的T细胞进行共培养,培养72h后,收集T细胞,annexin-V和PI双染,流式分析T细胞凋亡率。结果显示与HBx--HepG2细胞共培养相比,T细胞与HBx~+-HepG2共培养后凋亡率明显增加。有趣的是,在共培养之前加入B7-H1中和性抗体时,T细胞凋亡显著下降,证实HBx诱导的B7-H1信号促进了共培养系统中T细胞的凋亡。 综上所述,本研究分析了HBx与B7-H1在肝癌形成中的潜在联系,我们利用人的肝细胞癌细胞株HepG2细胞,转染含HBx基因的质粒后能稳定表达HBx蛋白。基因芯片及定量实时PCR均证实与转染空载体的HepG2细胞比较,转染HBx基因的HepG2细胞其B7-H1 mRNA的水平显著增加。流式与蛋白免疫印迹进一步证实HBx~+-HepG2细胞其B7-H1蛋白水平明显增加。构建含B7-H1启动子荧光素酶报告基因的质粒,荧光素酶报告系统分析表明B7-H1基因转录起始位点上游的128与137 bp之间的NF-κB结合位点可能在HBx诱导B7-H1表达起一定作用,定点突变及阻断试验进一步证实了NF-κB在HBx诱导B7-H1表达起主要作用。HBx~+-HepG2细胞与T细胞共培养试验表明T细胞的凋亡显著增加,当使用中和性的B7-H1抗体时,凋亡的T细胞明显减少,证实了HBx通过增强B7-H1信号促进了T细胞的凋亡。我们的结果表明HBx刺激肝细胞B7-H1的表达,随后导致T细胞的凋亡,最终可能促进了肝细胞癌的形成。


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