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内毒素拮抗肽抑制脂多糖诱导的过度炎症反应及其机制研究

段光杰  
【摘要】:脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),也称为内毒素(endotoxin)是内毒素血症(endotoxemia)及脓毒症(sepsis)最主要的致病因子。LPS致病作用的关键在于其通过激活Toll样受体4(toll like receptor 4, TLR4)跨膜信号通路,活化宿主免疫细胞,促进细胞因子和炎症介质的过度释放,导致机体组织损伤、多器官衰竭甚至死亡。因此,抑制TLR4跨膜信号通路的激活是防治LPS诱导的过度炎症反应的有效策略。 LPS诱导TLR4跨膜信号通路的激活受到多种信号蛋白/受体的调控,其中脂多糖结合蛋白(LPS-binding protein,LBP)、CD14、髓样分化蛋白-2(Myeloid differentiation protein-2,MD-2)和TLR4是最重要的调控分子。LBP是介导LPS与靶细胞表面受体CD14结合的重要载体蛋白,可催化放大LPS诱导的炎症级联反应100~1000倍,是导致脓毒症患者死亡的主要原因之一。而MD-2则被认为是LPS激活TLR4跨膜信号通路所必需的受体分子,在该通路调控过程中发挥着不可替代的作用。对于TLR4跨膜信号通路活化的拮抗研究,LBP和MD-2可能是其中最为合理的关键治疗靶点。 基于此,本研究拟在既往工作基础上,分别以TLR4跨膜信号通路中两个最为关键的调控蛋白(载体LBP和受体MD-2)为目标分子,利用生物信息学分析蛋白结构与功能的关系,设计构建新的针对LBP和MD-2的小分子内毒素拮抗肽,并对其体外和体内抑制LPS诱导的过度炎症反应及可能机制进行初步研究,以期获得具有高拮抗LPS活性的内毒素拮抗肽,为脓毒症的防治提供有益的探索和尝试。 主要实验方法与结果: 1.以TLR4跨膜信号通路的关键载体LBP第91-108位氨基酸残基组成的多肽,即内毒素结合肽(endotoxin binding peptide, EBP)为亲代模板,基于增加EBP的疏水性、正电荷数,构建合理的两亲性小分子多肽的设计原则,通过氨基酸替换构建了一组内毒素结合肽突变体(mutants of endotoxin binding peptide, mEBPs);采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成EBP、mEBPs以及对照肽(EBP scrambled peptide, ESP),并利用显色基质鲎试剂法(CE-TAL)从中筛选获得1条比EBP中和LPS活性更强的突变体mEBP9(氨基酸序列为: WKVRASFFKLKGSFKVSV)。 2.体外活性检测结果显示mEBP9呈剂量依赖性中和LPS活性,并可竞争性抑制rLBP与LPS结合,抑制效应明显强于EBP(P0.05)。进一步的细胞学实验显示mEBP9可显著抑制人THP-1细胞(经豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbol myristate acetate, PMA)诱导分化为成熟巨噬细胞)和小鼠RAW264.7细胞对LPS刺激的过度反应,明显降低效应细胞TNF-α和IL-6分泌及TNF-αmRNA表达水平(P0.05);且对该两种细胞生长均无可见的毒副作用。 3.体内生物学效应评估显示mEBP9对LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型具有比EBP更好的保护效应,可明显降低LPS刺激24h后小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)内的中性粒细胞和巨噬细胞数量、总蛋白及TNF-α水平(P0.05),明显减少小鼠肺部支气管周围和肺泡间隔内的炎性细胞浸润。而且,mEBP9还可明显降低烧伤合并内毒素血症模型小鼠48h死亡率,降低血清转氨酶ALT和AST活性及TNF-α水平(P0.05)。 4.针对TLR4跨膜信号通路的必需受体MD-2,在分析其结构与功能的关系基础上,设计构建了1条新的源于MD-2蛋白本身的模拟肽(MD-2 mimetic peptide,MDMP),其氨基酸序列为:CHGHDDDYSFCFSFEGILFPKGHYR,由理论上推测的MD-2蛋白的两个独特的功能结构域组成:MD-2与TLR4的结合域(Cys95-Cys105)及MD-2与LPS的结合域(Phe119-Lys132)。 5. ELISA直接结合及鲎试剂中和试验显示,经Fmoc固相合成的MDMP不仅可与LPS结合,还呈剂量依赖性抑制LPS诱导的LAL活化,而对照肽(MD-2 scrambled peptide, MDSP)则无类似效应。进一步研究发现用MDMP预处理可明显减弱RAW264.7细胞对LPS刺激的反应,包括下调RAW264.7细胞表面TLR4-MD-2复合体的表达、抑制FITC-LPS与RAW264.7细胞的结合、降低MAPKs和NF-κB信号通路的活化及TNF-α分泌水平(P0.05)。 6.在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中,MDMP预处理可显著减少LPS刺激24h后支气管肺泡灌洗液(BALF)内中性粒细胞和巨噬细胞数量、总蛋白和TNF-α分泌水平(P0.05);并减少小鼠肺组织的炎性细胞浸润。MDMP预处理对LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤亦具有保护效应,可显著降低模型小鼠死亡率、减少肝组织内炎症反应和肝细胞坏死、降低血清ALT、AST活性和TNF-α水平(P0.05)。 结论: 1.利用生物信息学技术对LBP的LPS结合位点肽段进行选择性突变和改建,成功筛选获得比亲代EBP拮抗LPS活性更强的突变体mEBP9。活性检测分析显示,mEBP9可能是通过直接中和LPS及竞争性阻断LBP与LPS结合,从而在体内外抑制LPS诱导的过度炎症反应。该研究结果为以抑制LBP的催化放大效应为靶标的脓毒症防治策略提供了新的实验依据。 2.基于蛋白质结构与功能的关系而设计构建的MD-2模拟肽(MDMP)可在体外和体内抑制LPS诱导的过度炎症反应,MDMP的这种拮抗效应可能与其中和LPS活性、下调TLR4-MD-2复合体表达以及降低MAPKs和NF-κB信号激活有关,提示针对MD-2的拮抗治疗是抑制TLR4跨膜信号通路激活的有效途径之一,为脓毒症的防治提供了新的研究思路。 3.上述结果表明针对LBP和MD-2设计构建的小分子内毒素拮抗肽,均可在一定程度上抑制LPS诱导的过度炎症反应。但TLR4跨膜信号通路的激活是一个极其复杂的过程,对单一分子的阻断可能还不足以完全拮抗LPS活性,目前的实验结果为下一步联合应用mEBP9和MDMP进行多位点协同拮抗研究奠定了理论和实验基础。


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