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ITGB4BP对创面修复中成纤维细胞的影响及其相关机制研究

谭江琳  
【摘要】:增生性瘢痕是皮肤真皮层受到严重创伤后的一种病理性愈合,产生的瘢痕及其挛缩不仅影响了患者的容貌,还能导致受伤部位功能障碍,严重影响了患者的生活质量。虽然近60年来得益于治疗手段的不断提高,大多数烧伤、创伤患者的生命得以挽救,但由于创面愈合晚期形成的增生性瘢痕的发病机理尚未完全明了,因此无论是外科手术还是药物治疗对于增生性瘢痕仍无明显疗效。因此深入研究增生性瘢痕形成的机制,寻找增生性瘢痕产生的相关特异性基因是目前创伤外科研究领域的热点、重点、难点问题之一。 皮肤创伤后,创周出现缺血缺氧、炎症反应,创周微环境改变,在以TGF-β1为主的细胞因子和机械应力的作用下,创周静息成纤维细胞向具有收缩功能的肌成纤维细胞转化。在创面正常愈合中,肌成纤维细胞逐渐凋亡,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)降解,但是在增生性瘢痕愈合中肌成纤维细胞凋亡受到抑制而持续存在,活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞分泌大量的细胞外基质,造成胶原、蛋白多糖、糖蛋白等过度沉积和胶原纤维排列紊乱,细胞外基质的产生和降解失衡,同时肌成纤维细胞的α-平滑肌肌动蛋白能导致创面收缩引起功能障碍。 目前治疗增生性瘢痕主要是通过控制瘢痕中过多基因或蛋白的表达等方式,但尚未取得显著疗效。因此我们逆向思考,是否可以寻找瘢痕中表达下降的基因或蛋白,通过增加其表达,实现更好的控制瘢痕形成的目的。寻找的策略是瘢痕中高表达的基因或蛋白抑制了在正常情况下高表达的基因或蛋白(即与正常皮肤组织比较,瘢痕中低表达或不表达的基因或蛋白),而此被抑制的基因或蛋白正是控制正常皮肤组织不转变为增生性瘢痕的关键因素;并进一步设想,该低表达的基因或蛋白是与瘢痕中高表达的基因产物有关联的。为此,我们对增生性瘢痕和正常皮肤内的差异表达基因进行筛选,发现P311基因高表达于新生的增生性瘢痕内,促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,是促进增生性瘢痕形成的关键基因之一。因此,我们以P311为切入点,寻找与其相互作用的、但在瘢痕组织中低表达或不表达的基因或蛋白。通过酵母双杂交技术和荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术筛选出P311的相互作用蛋白:整合素β4结合蛋白(Integrin beta 4 binding protein,ITGB4BP)。ITGB4BP,又名真核启动因子6(eIF6)、p27BBP,能与整合素β4(ITGB4)胞浆区发生相互作用。研究发现:一方面ITGB4BP作为真核起始因子参与调节核糖体40s和60s的结合形成80s亚基,也能参与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)的形成而调控mRNA的降解;另一方面,ITGB4BP参与调节Wnt信号通路中的β-catenin的表达,通过影响细胞骨架和粘附发挥调控细胞分化的作用。因此,一方面ITGB4BP可能通过下调促瘢痕形成相关基因和蛋白达到抑制瘢痕形成的目的;另一方面ITGB4BP也可能通过调控细胞骨架和粘附,影响细胞应力的感知而抑制肌成纤维细胞的形成。在此基础上,我们进行了系统的研究,主要涉及以下三个方面:1)ITGB4BP基因和蛋白在不同来源的成纤维细胞和不同组织中的差异表达;2)通过体外试验:在增生性瘢痕来源的成纤维细胞中强制高表达ITGB4BP后,观察靶细胞在该基因作用下的功能变化及其可能的分子信号通路;3)通过在体纤维化疾病模型,观察ITGB4BP对不同组织纤维化的影响。 1、ITGB4BP低表达于增生性瘢痕来源的成纤维细胞 我们首先收集了烧伤后增生性瘢痕组织和其同体对照正常皮肤组织进行原代分离、培养获得了增生性瘢痕来源的成纤维细胞和正常皮肤来源的成纤维细胞,然后利用Real-Time PCR技术和Western Blotting技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测了增生性瘢痕来源的成纤维细胞和正常皮肤来源的成纤维细胞中ITGB4BP的表达,结果发现ITGB4BP基因无论是mRNA水平还是蛋白水平均低表达于增生性瘢痕来源的成纤维细胞。同时我们检测了正常成人皮肤和增生性瘢痕皮肤中ITGB4BP的表达。结果发现:在正常成人皮肤和增生性瘢痕皮肤中ITGB4BP主要表达在表皮层的基底细胞的胞浆中,同时ITGB4BP在正常皮肤真皮层的成纤维细胞中也有表达,主要分布在细胞胞浆中,但在增生性瘢痕皮肤真皮层成纤维细胞中却未见明显阳性细胞的表达。因此提示胞浆ITGB4BP(+)的成纤维细胞是生理成纤维细胞,而胞浆ITGB4BP(-)细胞是纤维化型成纤维细胞。 2、ITGB4BP抑制肌成纤维细胞的生物学功能 ITGB4BP强制高表达于增生性瘢痕来源的成纤维细胞后,我们利用Real-Time PCR技术和Western Blotting技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)、TGF-β1(转移生长因子-β1)、CollagenⅠ(Ⅰ型胶原)的变化,并且利用FPCL(Fibroblasts Populated Collagen Lattice,成纤维细胞胶原网架系统)模型检测胶原收缩。结果表明:ITGB4BP能够抑制α-SMA、TGF-β1和CollagenⅠ的表达,同时抑制FPCL模型中凝胶的收缩。提示ITGB4BP具有使肌成纤维细胞去分化作用。 我们利用TGF-β1抗体封闭TGF-β1信号通路后,利用FPCL模型观察到ITGB4BP仍能抑制胶原的收缩,提示ITGB4BP抑制胶原收缩存在非TGF-β1依赖机制,因此我们利用免疫共沉淀钓出ITGB4BP相互作用蛋白,通过质谱技术筛选出ITGB4BP相互作用蛋白α3-Catenin。 3、ITGB4BP抑制纤维化动物模型的纤维增生 由于目前缺乏理想的增生性瘢痕动物模型,所以我们利用大鼠背部皮肤线性切口模型和CCL4诱导大鼠肝纤维化动物模型来观察创面愈合后肉芽组织的多少和肝纤维化后胶原纤维的比例。结果发现在线性切口模型中ITGB4BP在创伤后第7天能明显减少大鼠背部皮肤线性切口后的瘢痕面积,在肝纤维化模型中ITGB4BP能有效降低大鼠肝纤维化后胶原的比例。 终上所述,本课题首先根据ITGB4BP在正常皮肤组织和增生性瘢痕组织中的表达分布特点,提示胞浆ITGB4BP阳性的成纤维细胞是生理型成纤维细胞,参与形成正常皮肤的真皮层,胞浆ITGB4BP阴性的细胞是纤维化型成纤维细胞,参与形成增生性瘢痕的真皮层。其次通过强制高表达ITGB4BP,从体外实验初步阐明了ITGB4BP一方面特异性下调TGF-β1蛋白的表达,抑制TGF-β1-Smad信号的传导,使增生性瘢痕内肌成纤维细胞的表型发生逆转,表达α-SMA、分泌Ⅰ型胶原降低,细胞收缩能力受到抑制,从而抑制增生性瘢痕的形成。另一方面作用于胞浆中的α3-Catenin参与调节β-catenin信号通路,影响增生性瘢痕相关基因的转录和翻译和细胞-细胞粘附。最后通过体内纤维化动物模型证明ITGB4BP能相对量地(非绝对量)控制纤维化,缩短创面愈合时间。因此,我们研究提示ITGB4BP通过TGF-β1信号通路和β-Catenin信号通路抑制肌成纤维细胞的生物学功能,逆转成纤维细胞向肌成纤维细胞分化(肌成纤维细胞去分化),有限控制皮肤组织和肝脏组织病理性纤维化。ITGB4BP有可能作为治疗纤维化新的药物靶点。


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