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CCL5在卵巢癌干细胞侵袭转移中的作用及其机制研究

谢荣凯  
【摘要】:研究背景 卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,其死亡率居妇科恶性肿瘤之首,已成为严重威胁妇女生命和健康的疾病。癌的侵袭转移是卵巢癌最主要的临床特征。因此,深入阐明卵巢癌侵袭转移的分子机制是提高其临床诊断和疗效的关键。肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是一群具有自我更新和无限增殖能力,并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。新近研究发现CSCs是转移瘤生长的“种子”,肿瘤转移的本质就是CSCs的转移,但肿瘤干细胞如何参与肿瘤的侵袭转移及其具体分子机制仍待进一步研究。 近期研究发现趋化因子及其受体介导了众多类型CSCs的侵袭转移,我们推测卵巢癌干细胞也可能通过高表达趋化因子及其受体从而维持其侵袭转移特性。 目的 分析趋化因子及其受体对卵巢癌干细胞侵袭转移的影响,并进一步探讨CCL5及其受体介导卵巢癌干细胞侵袭转移特性及具体分子机制,为寻找卵巢癌转移防治的分子靶点提供实验依据。 方法 1.应用无血清培养及磁珠分选的方法从卵巢癌患者组织标本及细胞株中采用CD133作为标记获得卵巢癌干细胞。经成球、分化实验、免疫荧光和SCID小鼠成瘤实验和其组织病理及免疫组织化学鉴定卵巢癌CSCs。 2.应用RT2 Profiler? PCR array比较卵巢癌CSCs与卵巢癌细胞之间炎症相关因子的表达差异。并采用real-time PCR,ELISA方法对RT~2 Profiler~(TM) PCR array的结果进行验证。 3. Transwell实验分析CCL5对卵巢癌CSCs侵袭转移特性的影响。流式细胞术方法检测A2780细胞株及卵巢癌病人标本中CCL5受体CCR1,CCR3及CCR5的表达情况。阻断CCL5受体Transwell实验,进一步明确在介导卵巢癌CSCs侵袭转移特性中与CCL5相互作用的具体受体分子。 4.应用Transwell侵袭实验检测PDTC阻断NFκB后卵巢癌CSCs侵袭能力,用ELISA法检测CCL5及其受体阻断后NF-κB核蛋白活化情况。 5.应用定量RT-PCR方法检测CCL5及其受体阻断、NF-κB阻断后卵巢癌CSCs表达MMP-9的情况。 结果 1.我们已从卵巢癌组织及细胞株A2780中采用无血清干细胞培养基的方法成功诱导出卵巢癌CSCs,卵巢癌CSCs在体外呈“球状”生长,CD133表面分子阳性率达80%及90%以上,干细胞标志物OCT-4,Nanog及CD133的表达明显高于普通肿瘤细胞,体内移植瘤实验表明所得CSCs具有很强的成瘤性。体外基质胶侵袭实验表明卵巢癌CSCs侵袭能力明显高于普通肿瘤细胞。 2. RT~2 Profiler~(TM) PCR array结果表明CD133~+的卵巢癌细胞较CD133~-细胞在炎症相关因子的表达上存在明显差异,CD133~+细胞较CD133~-细胞表达高水平的趋化因子(CCL2, CCL5, CLL27, CXCL16等)及趋化因子受体(CCR1, CCR3, CCR5, CXCR4, CCR7等)。通过定量PCR及ELISA法在卵巢癌病人组织标本中分选的CD133~+细胞及CD133~-细胞均得到证实。 3.卵巢癌CSCs较普通的肿瘤细胞具有更强的侵袭转移能力。通过中和抗体阻断CCL5后发现,卵巢癌CSCs侵袭及迁移能力受到明显抑制。进一步研究表明CCL5受体CCR1及CCR3参与CCL5介导的卵巢癌高的侵袭转移能力。 4.NF-κB参与卵巢癌CSCs的高侵袭转移特性,阻断CCL5或其受体(CCR1,CCR3)后NF-κB的活性受到明显抑制。 5.卵巢癌CSCs高表达金属蛋白酶MMP-9,阻断CCL5或其受体CCR1,CCR3,及NF-κB后,卵巢癌CSCs上MMP-9的表达受到明显抑制。 结论 1.分别从卵巢癌组织标本及细胞株中分离培养出具有自我更新及分化潜能,致瘤能力强的卵巢癌CSCs。 2.卵巢癌CSCs高表达趋化因子及其趋化因子受体,自分泌CCL5,并高表达其相应受体CCR1,CCR3及CCR5。 3. CCL5介导卵巢癌CSCs的侵袭及迁移特性,并且与其受体CCR1及CCR3相互作用发挥效应。 4. CCL5活化NF-κB信号通路,进而上调MMP-9的表达从而参与卵巢癌CSCs的侵袭转移特性的维持。 5.卵巢癌CSCs自分泌CCL5并通过与CCR1和/或CCR3受体结合,活化NF-κB信号通路,进而上调MMP-9的表达,最终维持其高侵袭转移特性,可能是卵巢癌干细胞维持其高侵袭转移特性的潜在分子机制。


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