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姜黄素-3通过恢复肺癌细胞内WIF-1表达诱导肺癌细胞凋亡机制研究

刘煜亮  
【摘要】:背景和目的: 肺癌是世界范围最常见的一种死亡率极高的一种肿瘤。尽管现在可以早期诊断、化疗、放疗和免疫治疗,但其五年生存率仍低于15%。最近几年,小分子抑制剂,主要是表皮生长因子受体相关的药物,如:吉非替尼和埃罗替尼,已经被证明可以明显提高治疗效果和较少的副作用。尽管表皮生长因子受体相关性药物已经被广泛应用,但是表皮生长因子受体阴性的病人中存在明显的药物抵抗。现在急需研究作用于其他异常信号通路的抗肿瘤的新药物。 1973年Sharma在对果蝇的发育研究中发现了无翅基因(wingless),1982年Nusse在小鼠乳腺肿瘤中发现了整合基因(int);后来的研究证实果蝇的int基因就是wingless基因,故将有关的基因统一命名为wnt基因族。研究发现Wnt家族蛋白可以通过下游蛋白质传递信号来控制细胞发育和调节生长。Wnt信号传递途径从胞外至胞内,主要有:Wnt蛋白(主要编码分泌型糖蛋白)、细胞膜上Wnt受体蛋白、β-catenin(β-连环蛋白)、APC复合蛋白(一种为GSK-3β激酶,另一种是axin或conductin)、Lef/Tcf(lymphoid enhancer factor/T-cell factor)转录因子家族等。Wnt信号通路一般在胚胎发育时期表达,而在成熟机体中Wnt信号下调或缺失。大量研究发现,Wnt信号的异常表达将激活与细胞周期及增殖相关的原癌基因,促进肿瘤发生。 在结肠癌中常发现APC及β-catenin基因变异,导致Wnt通路持续激活,而抑制Wnt信号通路则被认为是一种有效的抗肿瘤途径。虽然大量证据表明Wnt信号通路在肺癌的发生发展过程中起重要作用,然而与结肠癌不同,人的肺癌组织及细胞系中很少观察到APC及β-catenin基因突变。 已有证据显示在肺癌细胞系及组织中存在Wnt配体的上调。过度表达的Wnt配体导致细胞质/细胞核内β-catenin在肺癌细胞中异位激活,并激活下游靶基因(主要编码一些原癌基因和细胞周期调控因子)的转录。虽然肺癌细胞中的Wnt配体过度表达的原因尚不清楚,但其中一个重要的原因是Wnt拮抗蛋白的缺失。在正常细胞内存在一定含量的Wnt配体抑制因子-1(Wnt inhibitory factor-1,WIF-1),通过与Wnt配体结合以防止Wnt通路过度激活。研究表明,WIF-1在肺癌细胞中呈低表达,削弱了其结合Wnt配体从而抑制Wnt通路持续激活的作用。此外还发现,WIF-1低表达甚至不表达的肺癌标本中WIF-1启动子几乎都存在WIF-1启动子高甲基化。由此可见,肺癌细胞中wnt通路发生异常激活的重要原因之一是因为WIF-1启动子区域的高甲基化,而使wnt配体失去抑制性调节。逆转肺癌细胞内WIF-1启动子高甲基化状态,恢复WIF-1在肺癌细胞中的表达水平,进而抑制wnt通路持续激活,成为需要解决的关键问题。 地西他滨和阿扎胞苷分别于2006年和2004年通过美国食品与药物管理局审核,进入临床中使用核苷类DNMT抑制剂,其能够在DNA复制过程中掺入DNA,然后被DNA甲基化酶识别,通过与DNMT半胱氨酸残基上的巯基共价结合而使酶失活[11]。然而由于核苷酸类似物嵌入DNA的特性导致其在治疗过程中毒性过大,使得很多患者不得不停止治疗。因此,发现新的具有去甲基化功效且毒性较低的药物是亟待解决的问题,植物来源的天然化合物有着极大的优势。 姜黄色素是姜黄、莪术和郁金等姜黄属药用植物的酚性色素成分,以中药姜黄中的含量为最高。姜黄色素主要含有姜黄素(姜黄素-1)、脱甲氧基姜黄素(姜黄素-2)和双脱甲氧基姜黄素(姜黄素-3)等3种成分,是一种化学混合物。最近有研究报道,通过计算机辅助建模,将姜黄色素中的三种单体物质三维分子结构分别与DNMT的三维模拟活性结构域进行结合,发现具有α,β不饱和羟基结构的姜黄色素可能具有共价性抑制DNMT活性的作用。姜黄素-3是否在细胞水平上具有去甲基化的作用,对哪种甲基化酶具有特异性作用,其对WIF-1高甲基化状态是否具有逆转作用,其结果能否对Wnt通路产生影响?这些问题尚且需要我们进一步验证。 为了验证上述推测,本研究分为三部分进行。第一部分比较类姜黄素类物质的低甲基化能力,观察它们对非小细胞肺癌是否具有低甲基化作用,能否通过低甲基化作用来恢复肿瘤细胞中的WIF-1的mRNA和蛋白表达。第二部分采用蛋白免疫印迹、EMSA、凋亡测定等分子生物学技术,探讨姜黄素类化合物对Wnt信号通路影响,并且探讨是否通过Wnt通路促进肿瘤细胞凋亡,并通过在体实验验证姜黄素类化合物的促凋亡作用。第三部分研究姜黄素类化合物低甲基化的机制,通过ELISA,RT-PCR、Western blot及基因测序等技术来观察它对甲基转移酶(DNMT1)的mRNA和蛋白表达的影响,探讨姜黄素类化合物低甲基化的机制。 材料与方法: 整个研究采用离体实验和在体实验。离体实验主要以非小細胞肺癌几种细胞系作为研究对象,通过RT-PCR、甲基化PCR、western blot、基因测序、EMSA、流式细胞术等来检测类姜黄素物质的低甲基化作用及对WIF-1和Wnt信号通路的影响。在体实验将非小细胞肺癌A549细胞种植于裸鼠皮下,通过不同的方式干预(普通饮食和姜黄素类化合物饮食)来研究姜黄素类化合物的抗肿瘤作用。 1.选用非小细胞肺癌A549、H460和SPC-A-1作为研究对象,利用甲基化PCR来观察肿瘤细胞内的WIF-1启动子的甲基化状态。 2.选用非小细胞肺癌A549、H460和SPC-A-1作为研究对象,使用不同的类姜黄素化合物干预细胞,观察它们的低甲基化作用。 3.使用非小细胞肺癌A549作为研究对象,利用不同浓度的类姜黄素化合物干预细胞,观察它们对WIF-1的mRNA和蛋白表达的影响。 4.利用RT-PCR、Western Blot、甲基化PCR和基因测序技术,观察不同浓度的双去甲氧基姜黄素通过低甲基作用对WIF-1的mRNA和蛋白表达的影响,检测其对WIF-1启动子低甲基化作用的比较。 5.使用非小细胞肺癌A549作为研究对象,利用ELISA、凝胶迁移滞后实验和免疫蛋白印迹等技术来观察双去甲氧基姜黄素对Wnt信号通路的影响。 6.使用流式细胞仪技术来观察双去甲氧基姜黄素对非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响;通过PCR技术来观察凋亡相关基因的变化。 7.采用NOD/SCID小鼠作为研究对象,通过不同的方式干预(普通饮食和双去甲氧基姜黄素)来观察双去甲氧基姜黄素的抗肿瘤作用。 8.使用ELISA方法,特异性核苷酸探针来检测姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素这三种具有潜在低甲基化作用物质的与甲基转移酶DNMT1的直接作用。 9.通过基因技术构建沉默DNMT1基因的siRNAi,并通过RT-PCR、Western blot及基因测序等技术来观察它对DNMT1的mRNA和蛋白表达的影响,其次观察其对WIF-1启动子的甲基化的影响,并检测双去甲氧基姜黄素是否能引起DNMT1缺失的肺癌细胞的去甲基化。 结果: 1.WIF-1在非小细胞肺癌A549、H460和SPC-A-1细胞系呈明显的甲基化状态。 2.姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素具有不同的低甲基化能力。 3.类姜黄素类物质对A549、H460和SPC-A-1细胞内WIF-1启动子区域具有低甲基化作用。 4.类姜黄素类物质可恢复A549细胞中WIF-1的mRNA和蛋白表达。 5.双去甲氧基姜黄素通对启动子的低甲基作用恢复WIF-1的表达。 6.双去甲氧基姜黄素在A549细胞中下调Wnt通路信号。 7.双去甲氧基姜黄素诱导A549细胞凋亡。 8.双去甲氧基姜黄素诱导Wnt通路相关的凋亡基因表达。 9.进食双去甲氧基姜黄素可以抑制小鼠皮下移植肿瘤的形成,同时伴有肿瘤的自发性坏死。 10.双去甲基姜黄素有直接抑制DNMT1活性的作用,但不能影响DNMT1表达。 11.构建的靶向DNMT1的siRNA可明显下调靶基因DNMT1的mRNA。 12.构建的靶向DNMT1的siRNA可显著下调DNMT1的蛋白表达。 13.构建的靶向DNMT1的siRNA可通过下调DNMT1的基因和蛋白表达,逆转WIF-1基因启动子高甲基化水平。 14.双去甲氧基姜黄素通过作用于DNMT1引起WIF-1启动子区域去甲基化。 结论: 1.类姜黄素类物质可以改善非小细胞肺癌中WIF-1高甲基化状态;类姜黄素类物质可以通过低甲基化作用恢复A549细胞中WIF-1的mRNA和蛋白表达。 2.双去甲氧基姜黄素通过低甲基化作用恢复WIF-1的表达,抑制DNMT1活性,下调Wnt信号通路,影响Wnt通路相关凋亡基因,诱导A549细胞凋亡,抑制肿瘤的生长和发展,促进裸鼠皮下移植瘤自发性坏死。 3.双去甲氧基姜黄素在体外对DNMT1有直接抑制其活性的作用;通过构建的靶向DNMT1的siRNA对肿瘤细胞中DNMT1和WIF-1的作用,证实了WIF-1基因启动子的高甲基化状态可以通过抑制DNMT1的活性而逆转。


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