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HSP90基因多态性与严重创伤后多器官功能障碍的关系及其阻断剂的抗炎作用机制

赵艳  
【摘要】:随着社会的进步和现代化交通工具的发展,严重创伤及并发的多器官功能障碍无疑成为常见而重要的临床危重疾病,尤其是多器官功能衰竭,是临床危重患者的重要死因之一。然而创伤程度相同(ISS评分相当)的患者发生这种并发症的几率并不相同,经过相同的治疗后有的患者病情减轻,有的患者病情不断恶化。随着人类基因组研究的不断深入,人们逐渐认识到遗传背景的差异是包括创伤在内的多种疾病发生、发展和预后的物质基础。 热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是广泛存在于从细菌到真核生物细胞内的保守的分子伴侣蛋白,在机体遭受创伤、感染、手术、缺氧、重金属、放射等应激条件下大量增加,保护机体内环境的稳态。HSP90作为热休克蛋白的一种,有众多与炎症相关的客户蛋白,其中包括具有抑炎效应的HPA轴的重要效应分子GR和具有促炎作用的TLR4信号通路的相关分子等。鉴于HSP90在炎症反应中的重要作用,其基因多态性与创伤后炎症反应及器官功能的损伤有何关系,如何提高HSP90的抑炎效应是本课题的关注重点。 为此,本课题拟对重庆地区部分汉族人和严重创伤患者的HSP90β基因SNP进行检测、分析和比较,了解各SNP的发生频率及其基因型分布特点,并采用体外细胞实验对不同基因型携带者的白细胞LPS刺激后HSP90β基因表达水平的变化及炎性因子的表达水平进行检测。通过构建含不同HSP90基因型启动子的荧光素酶表达载体验证SNP对HSP90β基因转录活性的影响。在此基础上,观察不同的基因型与严重创伤患者的多器官功能的损伤严重程度的关系,进一步明确HSP90β基因SNPs在创伤后炎症反应以及多器官功能中的临床意义。 此外,尽管HSP90的保护作用已经得到认可,但是在不同的损伤模型中的作用机制尚不明确。有研究表明HSP90阻断剂也具有减轻炎症反应、降低脓毒症小鼠死亡率的保护效应,这与公认的观点相悖,如何调控HSP90才能使其更好发挥抑炎的保护作用,本课题拟对HSP90及其阻断剂看似矛盾的作用进行研究,以期阐明HSP90及其阻断剂产生保护作用的机制和条件。本课题通过CLP所致脓毒症模型和LPS诱导的细胞模型检测不同剂量条件下HSP90阻断剂17-AAG的作用,并分析主要抑炎信号通路GC-GR通路和促炎的TLR4信号通路,以及二者之间的关系,为发现和开发有效的抗炎药物提供理论支持和实验依据。 主要结果与结论如下: 1.重庆人群中HSP90β基因启动子区存在七个高频突变位点,分别为-741G/C、-509C/T、-427A/C、-398 C/G、-257G/A、-144C/A和-141 T/C,其突变频率分别为0.260、0.250、0.250、0.220、0.313、0.285和0.434。其中-741G/C、-509C/T、-427A/C、-398 C/G、-257G/A五个位点呈紧密连锁,-144C/A、-141 T/C位点之间以及与以上五个位点之呈连锁不平衡关系。 2.体外转录活性检测的实验数据表明突变型-144A启动子较野生型-144C启动子具有更高的转录活性,可以促进靶基因的转录。定量PCR的结果证实-144突变型基因携带者的外周血白细胞具有较高的HSP90β的基础表达,并且在LPS诱导的炎症模型中具有较低的炎性因子TNF-α的表达,表明此位点为功能性多态位点,通过改变启动子的转录活性进而调节HSP90β基因的表达。 3.进一步的临床关联研究表明HSP90β基因-144AA基因型患者的多器官功能评分显著低于-144CC基因型,表明此位点SNP与严重创伤后各器官功能损伤的严重程度有关,我们推测-144位点突变导致的HSP90β表达水平的差异是导致炎症反应差异性的重要原因之一,在严重创伤患者并发症的发生和进展中具有重要意义。 4.在CLP小鼠脓毒症模型和LPS刺激的细胞模型中较低浓度的17-AAG (0.1μM)可以促发以HSP90表达增高为特征的热休克反应,降低TFN-α、IL-1β等炎症因子的表达水平,但较高浓度的17-AAG (0.5μM)尽管使HSP90蛋白水平增高,却具有相反的作用,增加炎症因子的表达,加重损伤。 5.在小鼠脓毒症模型中17-AAG可以显著的提高3h和24h时相点P-HSF1的水平因而提高HSP90的蛋白表达。低剂量17-AAG (0.5mg/kg)可以显著降低24h时相点TLR4的表达,而高剂量17-AAG (2.5mg/kg)对TLR4的表达无显著影响。 6.细胞实验的数据表明低和高剂量的17-AAG都可以显著的提高P-HSF1的水平,进而促进HSP90的转录和表达,并且呈剂量依赖性增高。但是仅当低浓度的17-AAG (0.1μM)存在时对机体产生保护作用,并且主要是通过促进GC-GR信号通路进而促进其调节的下游靶基因Lipocortin-1的表达而实现的。与此相反,高浓度的17-AAG (0.5μM)尽管增加了HSP90的表达水平,却可以抑制HSP90的活性进而阻断GC-GR信号通路,抑制Lipocortin-1的生成,进而促进炎性因子TFN-α的产生,加重损伤。 7.细胞实验表明分别单独给予低浓度的17-AAG (0.1μM)和DEX (50nM)都可降低TLR4的蛋白水平,并且二者同时使用具有协同作用,使TLR4的表达在24h表达更低。已有实验数据证明HSP90的增加可以促进GR的核转位而增强GR效应,因此我们推测表明17-AAG通过增加HSP90的表达促进DEX介导的GR效应,间接发挥抗炎保护效应。 总之,HSP90是一种具有保护作用的分子已被广泛认可,较低剂量的HSP90阻断剂由于其具有促进热休克反应和对客户蛋白的调节的差异性,使得较低浓度的阻断剂17-AAG可以通过诱导HSP90的表达进而促进GC-GR信号通路发挥保护效应,并且通过促进GC-GR效应间接抑制TLR4介导的炎症反应,因此,低剂量的HSP90阻断剂对于严重的炎症反应具有显著的保护作用,并且与DEX协同作用可以增强抗炎效果,同时减轻大剂量DEX带来的副作用,是一种较为理想的潜在抗炎药物。


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