胰岛素通过miR-208介导的p21下调刺激血管平滑肌细胞增殖的实验研究

【摘要】：一、研究背景 多种因素参与调节正常血管与病变血管的生长代谢,而胰岛素正是这些因素之一(1)。生理剂量的胰岛素可以保持VSMC处于正常的静止或低增殖状态,具有抗动脉粥样硬化作用,而高浓度胰岛素则促进VSMC增殖(2),诱发或加重动脉粥样硬化。临床实践也已经明确证实糖尿病患者中合并冠心病、高血压、脑卒中、高脂血症家族史较非糖尿病患者明显增高;针对冠心病患者调查发现空腹胰岛素水平最高组的既往心梗发生率和冠脉造影证实的冠脉明显狭窄均显著高于空腹胰岛素水平最低组。既往的研究认为高浓度胰岛素通过MAPK途径介导VSMC增殖(3),逐渐更多的研究发现胰岛素的信号途径远不仅于此,越来越多的中间信号分子以及相关调节因素牵涉其中,如细胞周期蛋白、各种激素受体、离子通道等(4-9),但鉴于胰岛素复杂的生理效应,胰岛素引起VSMC的异常增殖仍有许多不清楚之处,我们推测可能存在其他的关键分子及机制。寻找高胰岛素血症引起VSMC增殖的确切机理对于防治动脉粥样硬化具有重要意义。 MiRNA是近年日益受到重视的一种基因调控方式。成熟的miRNA与Argonaute蛋白(一种核酸内切酶)等形成RNA诱导的沉默复合体即RISC(RNA-induced silencing complex,RISC),通过与靶mRNA——通常是3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)——完全或不完全互补结合并行使调控功能,通常认为在大多数哺乳动物中的miRNA并不导致靶mRNA的降解,而是通过miRNA与靶mRNA 3’UTR不完全碱基互补配对,在转录后水平抑制基因翻译或增加mRNA降解。近年来的研究证明miRNA在心血管的生理及病理过程中均发挥重要作用(16-18)。 细胞增殖受细胞周期调控,非增殖细胞处于G1/G0期,受到促增殖因素刺激后细胞周期蛋白(cyclin)与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)形成复合体促使细胞进入S期进行有丝分裂,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinases inhibitory proteins,CDKI)则通过负向调控cyclin-CDK复合体而抑制细胞增殖。P21(又称p21 WAF1、p21WAF1/cip1、cdkn1a)属于CDKI家族成员,是一个极其重要的抑增殖因子,可以通过抑制CDK及作用于细胞增殖核抗原(proliferating-cell nuclear antigen,PCNA)抑制细胞增殖。血管损伤、辐射等因素通过抑制p21诱导VSMC增殖(46,47);而某些抑VSMC增殖因子则通过促进p21表达而发挥作用(45,48,49)。因此p21的正常表达在VSMC非增殖状态的维持中起重要作用。研究发现p21的编码区域相当稳定且高度保守,在数百种异常增生的肿瘤细胞中几乎从未发生突变,这种遗传学特点对于维持p21在各类型细胞中的稳定表达具有重要意义,同时提示我们基因编码区域以外的因素可能是导致p21异常表达的主要原因,因此p21的表观遗传(Epigenetics)调控显得尤为突出。表观遗传以不改变DNA编码序列,但对基因表达起重要调控作用为特征。包括MicroRNA(miRNA)、DNA甲基化(DNA methylation)、组蛋白修饰(histone modification)等方式。胰岛素通过何种方式调节p21变化?目前仍不清楚。 二、研究目的研究miRNA是否参与高浓度胰岛素介导的VSMC异常增殖以及参与其中的具体信号分子,进一步探讨血管平滑肌细胞增殖的机制,为血管增生性疾病的防治寻求新的理论和实验依据。 三、研究内容1、胰岛素促VSMC增殖过程中哪些miRNA发生变化; 2、胰岛素通过影响具体何种miRNA的变化发挥促VSMC增殖作用; 3、验证特定miRNA的下游靶蛋白4、验证miRNA及下游靶蛋白在介导胰岛素促VSMC增殖过程中的作用。 四、研究方法1、原代培养SD大鼠VSMC。2、H3-TdR、流式细胞仪检测VSMC的增殖情况。3、建立胰岛素促VSMC增殖的浓度曲线。4、通过MicroRNA芯片找到胰岛素刺激后VSMC产生有意义变化的miRNA,real time-PCR进行验证6、验证特定miRNA参与胰岛素介导的VSMC异常增殖7、高通量计算机软件分析寻找特定miRNA的下游靶蛋白8、构建荧光报告基因验证特定miRNA与下游靶蛋白的标靶关系9、验证特定miRNA的下游靶蛋白参与胰岛素介导的VSMC异常增殖 五、研究结果 1.高浓度胰岛素促进VSMC增殖 2.MiRNA参与胰岛素促进VSMC增殖的过程 3.MiR-208是胰岛素促进VSMC增殖途径中的重要调控因子 4.MiR-208可以通过“种子”序列与细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂CDKI家族中p21 mRNA3'UTR互补结合 5.MiR-208通过与p21 mRNA 3'UTR直接互补结合在转录后水平下调p21表达 六、结论高浓度胰岛素促进miR-208表达,miR-208在转录后水平负性调控下游靶蛋白p21,抑制p21表达,进而促进VSMC增殖。