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基因工程化胚胎干细胞用于AD治疗的基础实验研究

吴旋  
【摘要】:胚胎干细胞(ES细胞)是从附置前胚胎内细胞团或原始生殖细胞 (PGCs)经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系。因为ES细胞具 有分化为各种神经细胞的能力,并能通过核移植方法建立ES细胞系和基 因改造两条途径避免移植治疗带来的免疫排斥反应,所以目前被视为神经 移植材料的理想来源和基因治疗的理想载体细胞。 阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)是与中老年人记忆过早丧失 有关的神经变性疾病,AD的病理特征是在大脑皮层和海马区域出现β淀 粉样蛋白(amyloidβ,Aβ)沉积形成的老年斑,以及神经元的缺失。目前广 泛认为Aβ沉积是导致AD的主要因素。松果体分泌的激素——褪黑素 (melatonin,MT)水平降低与AD发病有关,MT能通过多条途径抑制A β的神经毒性,大量资料显示MT对AD的治疗效果,但是MT在生物体 内半衰期极短(外源性MT在血清中的半衰期仅为0.5到5.6秒),有必要 考虑其它的给药方式。本实验将合成MT的限速酶基因——AANAT转入 ES细胞中,一方面利用MT抗Aβ沉积和抗氧化作用,以阻断AD的致病 环节;另一方面利用ES细胞来源的神经前体细胞对AD缺失神经元的替 代作用,希望能用于AD的治疗。目前国内外尚未见基因工程化ES细胞 用于AD治疗的相关研究。 ES细胞直接移植到脑内,虽然能受环境信号的影响进行分化和整合, 但直接移植有形成畸胎瘤的危险。与ES细胞和成熟神经细胞相比,神经 前体细胞更适合于移植治疗。因此本实验第一部分探讨了ES培养方法和 获得高纯度神经前体细胞的方法。由于缺乏能造成Aβ过度分泌和沉积的 动物模型,阻碍了研究AANAT基因工程化ES细胞对AD的疗效,因此本 实验第二部分建立了A6过度分泌的细胞模型。在第三部分中我们观察了 AANAT基因工程化ES细胞条件培养液以及褪黑素对此细胞模型的影响。 将AANAT基因工程化的ES细胞体外分化为神经前体细胞,并移植到 AD动物模型脑中,研究其治疗效果是我们今后要做的工作。 第一部分 进行ES细胞研究的前提和基础是ES细胞的培养。ES细胞体外培养 的关键是既要保持细胞快速分裂增殖,又要维持其未分化状态。常用的方 法是用原代培养的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF) 作饲养层,同时在培养液中添加白血病抑制因子*eukemia inhibitory factoT3 LIF)以维持ES细胞的增殖和未分化状态。由于原代培养MEF工作烦琐 而且容易带来污染,我们在实验中应用一种新的饲养层——人胚胎成纤维 细胞,观察其对小鼠ES细胞(MESPU13)生长的影响。结果发现采用人 胚胎成纤维细胞培养小鼠ES细胞,其碱性磷酸酶染色为阳性,说明能够 保持ES细胞的未分化特性。与以往的饲养层相比,这种饲养层的优点是: 使用简便,避免污染,有利于支持ES细胞的转基因操作。 在ES细胞诱导为神经细胞的研究中,较早采用也研究较多的是用全 反式维甲酸Oetinoic acid,RA)诱导,但是由RA诱导得到的是神经元和 神经胶质细胞,得不到正常神经发育过程中所具有的神经前体细胞(neural prec。s盯 Cdls,NPC),另一途径是1996年Oh劝e提出的无血清培养法。无 血清的培养可获得较高纯度的NPC。NPC是较好的神经移植材料。国外已 将无血清培养获得的NPC用于移植研究,但是在国内还未见应用无血清培 养法由ES细胞培养神经前体细胞的报道,本实验采用无血清培养法获得 86%的 NPC,经巢蛋白免疫组化和 RTFCR鉴定为阳性。在实验过程中比 较了三种胚胎体的培养方法,以细菌培养皿结合液体培养基的方法简单易 行,并可一次获得大量的胚胎体。在胚胎体的贴壁方式上比较了以胚胎体 直接贴壁和消化成单细胞贴壁,发现前者存活的神经前体细胞比后者多。 在无血清培养液成分上,比较了 ITSF和 NZ,发现两者都能使神经前体细 Vlll 胞选择性生长,在NZ成分中添加纤维连接蛋白,能使存活的神经前体细 胞数量增多。 第二部分 目前采用的AD动物模型分为以下几类:()神经元直接损伤模型; Q)胆碱能系统功能损伤模型:门)转基因动物模型。前两种动物模型只 能模拟AD后期神经细胞坏死和行为改变,没有AD特征性的病理改变一 一AS沉积,转基因动物模型在复制脑内A6沉积方面效果不稳定,目前国 内尚缺乏能造成AD沉积的稳定动物模型。因此,本实验建立了AD过量 表达的细胞模型。利用分子生物学技术构建瑞典突变型APP695和绿色荧 光蛋白共表达载体。采用脂质体转染的方法,将其转染PC12和CHG*细 胞。激光共聚焦显微镜下比较各克隆的荧光强度,选择荧光强度高的 PC 和 CHG6细胞各一株,进行投射电镜观察、流式细胞仪检测以及放兔测定 培养液中AS浓度,结果发现:瑞典突变型APP转染能使PC12细胞形态 增大变长,微绒毛增多,分泌A6增多,细胞周


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