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胶质细胞多巴胺反应基因克隆及其特征分析

石军  
【摘要】: 多巴胺(dopamine,DA,化学名3,4-羟基苯丙胺)是中枢神经系统主 要的儿茶酚胺类神经递质,多巴胺参与控制机体运动、行为、情绪、摄食 及内分泌调节等。在中枢神经系统所有的慢作用递质中,DA是长期以来 受到最多关注的神经递质,主要原因是其与神经系统重大医学问题联系最 为紧密。临床上常见疾病如帕金森氏病(Parkinson's disease,PD)是中脑黑 质DA能神经元的选择性退变所致,亨廷顿氏舞蹈病(Huntington's chorea) 是由于纹状体内DA投射神经元的损害,目前所有的精神分裂症 (schizophrenia)治疗药物在本质上主要是以DA受体的拮抗剂起作用,注 意力缺陷/过敏障碍(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)的症状 可用DA能神经调节药物得到极大缓解。药物可卡因、苯丙胺、阿片与尼 古丁、酒精等通过调节DA神经传递而获得成瘾性。人们已越来越清楚地 认识到,DA在人类身心健康中具有非常重要的生理作用。DA的研究也 成为了当今神经科学中的前沿研究领域,为揭示人类思维和精神活动规律 及其有关疾病的奥秘提供了可能的途径。 尽管人们对DA的研究有广泛的兴趣,并且也取得了辉煌的成就,但 目前对DA发生作用的细胞和分子机制仍不清楚。随着近年来细胞或分子 水平研究的广泛开展,发现脑内除神经元以外胶质细胞也是DA作用的重 要靶细胞。事实上,脑组织主要由神经元和胶质细胞共同构成,数量上胶 质细胞与神经元比是10~50:1,胶质细胞占脑体积一半以上,已经表明 胶质细胞在神经系统具有非常重要的功能。最早的实验发现脑组织胶质细 胞的提取物有腺甘酸环化酶相关的DA受体,接着,发现DA可刺激皮质 和纹状体,非脑干来源的培养星形胶质细胞CAMP积聚。进一步应用电 生理和放射性配体结合自显影研究提示胶质细胞具有DA受体。我们应用 pH]DA放射性受体分析法(r。山。reCeptofN11山ng SSS。y,R RARA)研究发现 三个不同部位来源的星形胶质细胞具有5个不同的解离常数,表明胶质细 胞分布广泛而且具有部位异质特性。近期的研究利用分子生物学技术如 PCR和原位杂交,证实培养纹状体胶质细胞表达DI和DZ受体。另外, 胶质细胞具有类似神经元的DA摄取系统。由此可见,胶质细胞是脑内 DA作用的重要靶细胞,并且胶质细胞可能在DA神经系统疾病中具有非 常重要的作用。本研究利用细胞与分子生物学的多种技术方法,克隆与鉴 定系列胶质细胞DA的相关基因,并对部分新基因功能进行初步的特性分 析。一方面,从理论上有利于分析DA作用于星形胶质细胞的分子机制, 了解胶质细胞在*A神经系统中的生理功能:另一方面,可能获得*A系 统疾病的相关基因,对揭示帕金森氏病,精神分裂症和药物成瘸等疾病的 病因,提高临床诊断以及治疗水平有重要的应用价值。 本研究首先从大鼠脑组织分离培养星形胶质细胞,以多巴胺DA处理 后提取 mMx,然后结合应用抑制消减杂交侣u以ession subtractlve hybridization,SSH)和选择性差异筛选(PCR·Select Differential Screening) 方法,分离获得27个DA调节表达cDNA克隆。经Northern杂交验证, 序列测定与生物信息学分析,明确了 14个 DA调节表达的基因,包括神 经递质转运相关的多功能调节蛋白泛素蛋白连接酶Nedd4,调节细胞分泌 活动的内质网钙联结蛋白,能量代谢相关的葡萄糖调节蛋白,DA代谢相 关酶NAD(P)H-酮还原酶和NADH-泛酮氧化还原酶,以及铁蛋白H亚单 位等。实验结果提示*pA激活了胶质细胞内复杂的信号传递通路,并且 涉及生长因子信号途径、凿体激素信号途径和白介素调节通路之间的相互 交流(cros叶alking卜()信号传递的靶基因有四类:代谢酶,应激蛋白, 转运蛋白,以及生长发育调节蛋白等。O)其中几个基因变异与神经疾病 密切相关,也提示多巴胺能神经疾病与非多巴胺能神经疾病之间也有某些 共同的机制。 Vlll 人类基因的发现及功能研究,尤其重要疾病的相关基因研究是目前世 界范围的重大课题。多巴胺*opamine,DA)是中枢神经系统重要的神经递 质,与神经系统重大医学问题联系最为紧密。胶质细胞DA相关基因的克 隆对揭示胶质细胞在DA系统中的重要作用,以及对揭示帕金森病,精神 分裂症和药物成噶等DA系统疾病的病因,提高临床诊断以及治疗水平有 重要的应用价值。本研究采用同源克隆策略川 CIOllillg),采用 DA处理的大鼠星形胶质细胞的消减PCR探针,筛选人类胎脑cDNA噬 菌体文库。通过高质量全长cDNA噬菌体文库的构建,经过严格的杂交 的筛选,挑选了96个阳性克隆,经过测序分析明确了61条DA相关的全 长基因,并且筛选到数个全长的新基因。通过文献查阅与生物信息学分 析,比较全面地了解了DA激活星形胶质细胞的信号传递机制及其相关功 能意义,并且新基因的克隆为进一步的基因功能研究及其开发应用研究奠 定了重要的基础。 在我们筛选到的数条新的人类全长cDNA基因中,依据生物信息学 分析我们选择两


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