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基于表位的乙肝治疗性多肽的分子设计与免疫学特性研究

石统东  
【摘要】: 解决病毒持续存在的免疫学和病毒学机制、研究清除细胞内病毒感 染的特异性治疗方法和免疫干预药物是HBV研究重点。HLA-Ⅰ类分子介导 的T细胞免疫,特别是由抗原特异性CTL介导的细胞毒作用,是清除胞内 病毒感染的关键。所以研究基于HBV抗原CTL表位的新一代疫苗或免疫干 预药物,以在体启动T细胞介导的免疫应答,有望终止细胞内病毒感染。 由于天然病原体及抗原可通过多种机制逃避机体的免疫监视和免疫清除, 所以,必须对天然抗原分子及其表位肽进行重新设计,使改构后的新型免 疫原能够诱发与自然感染过程有所不同的免疫反应。 本课题采用InsightⅡ系列软件,对天然HBV Pre-S2、HBsAg和HBcAg 抗原进行分子结构模建,根据表位的优势性,选择HBV PreS_2蛋白的免疫 优势性B细胞表位(18-24)、Th细胞表位(37-53)和HBcAg的CTL细胞 表位(18-27)为研究对象。应用基于表位进行多肽和疫苗设计的技术路 线,以所筛选出的表位进行抗原设计。根据Chaiken等的研究,设计出短 而柔性较强的表位间连接顺序—AAA—。然后根据可能的组合方式对所筛 选出的表位进行合理组合与搭配,在计算机上进行分子结构模建,检查各 种组合方式对多肽空间结构的影响,有无空间位阻存在,并重新调整表位 组合,确定三种有代表性的多肽分子,即CTL表位肽、CTL+Th表位组合 肽、CTL+Th+B细胞表位组合肽。用Merrifield固相化学合成法进行多肽 合成,获得新型免疫原分子。 由于多肽尤其是短肽的免疫原性通常较低,达不到引起免疫应答的 水平。而且传统载体或佐剂免疫效果较差,因此本课题采用分子内佐剂的 设计思路,将P-KSS脂肽佐剂基团构建于多肽抗原分于内部,以捉高多JJ太 疫苗的免疫原性。激发体内CTL反应。降低毒副作用。P-KSS分别与确定 的三种多肽分子进行卜末端连接,经计算机分子结构模建,并与天然抗 原进行空间构象相似性、表位可及性等比较后,确定最佳连接顺序,构建 不同的分子内佐剂肽叫(含 CTL表位\ PAZ(含 CTL/l’h &位入 I“3(含 CTL、B、I’h表位人 并用固相化学合成法进行合成。 糖基化是蛋白质最重要的翻译后修饰形式,多肽链经某些形式的娜 译后修饰(如糖基化、脂化)之后,可能提高多肽与质膜的亲和力,提高 小肽分子对抗夕、热、蛋白酶的能力,提高多肽的稳定性。蛋白质或多肽 的翻译修饰参与并影响了T细胞应答,而T细胞对细胞表面蛋白的识别必 包括对糖基的识别。已有研究认为,多肽链侧链的一个糖基替代就能直接 与 MfIC分子和 TCR发生交互作用。近年来已有关于糖基化合成肽诱导 T细 胞应答的多项报道。HBV的表面抗原均是糖蛋白,有关11BV抗原糖基化的 研究主要集中在N-,0-糖基化方面,目前公认N-糖基化是HBV ;W粒组装 和分泌必需的,而0-糖基化则无直接关系。本课题选择N-糖基化修佣泊b 1诅V显性表位多肽和卜r钻蛋臼,同前进行计算机结构腆建后,用糖肽 化学合成法进行合成,获得基于 CTL表位的糖基化新型多肽抗原 GP(含 CTL表位)、GPZ(含CTL、1上表位)、GP3(含CTL、B、Th表位)。 上述多肽抗原分别进行化学切割,去除树脂与保护基团之后,再ll盯C 法进行纯化和鉴定,得纯化的多肽抗原,分别用于体内外兔疫学试验和细 胞靶向抗原的合成。 APC通过经典的胞吞、胞饮方式对抗原的摄取,无法保证抗原摄取 的特异性,且效率低下;而受体介导的内吞作用(Receptor medianed endocytosis)可保证摄取抗原的特异性,并能使抗原递呈效率提高 10‘-’倍。 本课题选择转铁蛋白特异性单抗的 F;仆;;。为细胞间靶向顺序,以特异性 地结合专职APC和非专职APC的受体。皿过引入专职APC和非专职APC 间的靶向基团,以期能启动T细胞与靶细胞之间的直接识别机制,从而 提高抗原的递呈效率,提高小肽分子的免疫原性。探讨影【I!①免疫应答效果 XI ;一\i 的因素,研究表位结构与兔疫应答的关系。所选择的细胞靶向结构与新设 计的表位连接顺序,经计算机分子结构建模、与天然抗原分子进行构象比 较和筛选之后,确定细胞靶向性多肽免疫原门。F3和 IgGI。Ier- SZ人 以戊二醛为交联剂,经手工液相连接之后,进行超速浓缩法、高效 液相色谱法和聚丙烯酚胺电泳法进行纯化和鉴定。 所得多肽抗原分别在 Balb儿(H上勺小鼠和和 HLA-AZ”正常人。急性 肝炎恢复期病人和慢性乙型肝炎病人的外周血淋巴细胞中进行了体内、外 试验,分别就其体内力诱导T细胞增殖、分化;诱导抗体产生:诱导Th汀 型 T细 ]Jfu极化;诱导 HBV抗原特异性 CTL产生及其介导的则胞Ity作)IJ 等功能进行了检测。比较研究基于不同表位组合的多肽分子的体内、外兔 疫学特性,其结构与诱导免疫应答的关系;研究脂类分子内佐剂和 APC 靶向基团的引入及糖基化


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