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去唾液酸糖蛋白受体介导的肝靶向阿昔洛韦的制备及初步研究

项贵明  
【摘要】: 目的:为减少抗病毒药阿昔洛韦(ACV)在治疗乙型肝炎中的毒副作 用,将药物与肝去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的特异性配体乳糖化多聚 赖氨酸偶联,研究经肝去唾液酸糖蛋白受体介导的肝靶向性。 方法:1.多聚赖氨酸(PLL,Mw 40,000Da)在氰硼酸钠的催化作用下 与乳糖发生还原反应生成乳糖化多聚赖氨酸,乳糖化多聚赖氨酸与咪唑化 阿昔洛韦在37℃ pH9.5的条件下反应合成药物-载体偶联物Lac-PLL-ACV。 2.偶联物的分子量经sephadex G-100凝胶过滤法确定,用溶菌酶 (14,400Da),卵清白蛋白(40,000Da)和牛血清白蛋白(66,200Da)作为分子 量标准品。偶联物中乳糖含量的测定用硫酸-蒽酮法,阿昔洛韦的含量测 定用紫外分光光度法,测定254nm的吸光度,根据吸收系数(E~(1%)=622)换算 成ACV的浓度及含量。3.建立测定ACV在血浆及肝、肾、脾等组织中的浓度 的高效液相色谱法(HPLC)。4.偶联物加在新鲜人空白血浆中配成1mg/ml 的浓度,37℃保温,在不同时间间隔(0,1,2,4hr)用PEG-6000沉淀蛋白和 偶联物,HPLC测定游离药物的浓度,以游离药物占偶联药物总量的百分比 评价其稳定性。5.昆明株小鼠,体重20±2g,随机分成20组,每组6只。ACV 和Lac-PLL-ACV生理盐水溶液分别按ACV5mg/kg体重尾静脉给药,给药后不 同时间点分别眼眶取血后断颈处死,取肝、肾、脾等脏器。全血离心分离 出血浆,脏器用生理盐水洗去残余血液,称重后加入0.1mol/L pH7.4磷酸 盐缓冲液制成匀浆,12%三氯醋酸沉淀蛋白,HPLC法测定血浆和组织匀浆 中的药物浓度。6.用3P87程序对血药浓度-时间数据和肝药浓度-时间数据 进行药代学处理,研究ACV及偶联物的药代动力学特性。7.昆明株小鼠, 体重20±2g,随机分组,每组10只。不同浓度的Lac-PLL-ACV、ACV及PLL 药液…H7.4)按0.lml/10g的用药量尾静脉注射给药后观察动物中毒症状及 死亡情况,了解偶联物的急性毒性。计算Lac千LLhCV、ACV及PLL的半数 致死量LD。。。 结果:1.偶联物分子量经sephadex G-100凝胶过滤法初步确定约为 56Kd,偶联物中乳糖及阿昔洛韦的含量分别为28.07土1.26%,10.02土 0.63饥 药物/载体的摩尔比约为28。与阿昔洛韦相比偶联物的水溶性大大 提高,在生理盐水中的浓度可达200mg/。1。2.HPLC法色谱条件:Beckman G。id系列高效液相色谱仪,ODS柱,流动相为甲醇-水(5:95,V/V),流 速1.0。1/min,检测波长254urn,柱温为室温。ACV标准品的保留时间 t广7.50血,血浆及组织样品的内源性物质对标准品无干扰;ACV浓度与 峰面积的线性关系良好什叫.99X 线性范围为0.120 n g/M格八 血浆和 组织匀浆的最低检测浓度分别为20ng/ml,50ng培;方法的天内及天间精 密度变异系数均低于6“ 方法平均回收率为100.35兄3.偶联物在新鲜人 空白血浆中37℃保温1小时后,游离药物的浓度仅占偶联阿昔洛韦总量的 3%4小时后仅占6“4.尾静脉注射ACV后,ACV在肾脏中浓度最高,血浆、 肝脏、脾脏中浓度均较低,12小时后已检测不到。各组织样品中ACV浓度 在 10分钟时达到峰值,肾脏峰值浓度为肝脏的 6倍左右,之后ACV浓度下降; i.v.Lac个LLACV后,各组织样品中ACV浓度的峰值延后,ACV在肝脏中浓 度最高,肝脏峰值浓度是 i.V.ACV组的 10倍左右而肾脏峰值浓度约为 i.V.ACV组的 1/4,12小时后各组织中仍可检出MV。5.由 F检验和拟合优 度判据可知,应选择权重系数为1儿儿的二室模型来描述i.V.ACV组和 i.v.Lac干LL叫CV组ACV小鼠体内的药代动力学特征。房室模型计算结果: i.V.LSC一PLL-ACV的主要药动学参数为:tl/2(。)=8.4696 h,AUC二18.6465 ug/ml *h,CL二 5.3461 ml从。分另为ACV组的5.7倍,1.6倍牙0.6倍。统 计矩方法分析结果:ti/2(卜,AUC,CL分别为ACV组的3.6倍,1.4倍和0.7 倍。6.尾静脉注射给药后,偶联物、ACV和PLL的半数致死量LD。。分别为 1503.42mg/kg、106.18mg八g和46.04mg/kg。 结论:1.偶联物能明显提高ACV的水溶性,LaC-PLL比其它载体的载 ·VI· 药量高。2.在人血浆中偶联物的稳定性较高,说明药物与载体之间的化学 键稳定。3.用建立的HPLC法测定血浆和各组织中的ACV浓度精密度高、 方便快捷。4.小鼠尾静脉注射给药后,Lac-PLL-ACV减少了药物在肾脏的 分布,而肝脏中ACV的浓度大大提高且维持时间较长。5.房室模型和统计 矩分析结果都说明,Lac干LL个CV较ACV在药代动力学特征上有较大的改 变,血浆和肝脏中药物的半衰期延长,清除率降低。6.小鼠尾静脉注射 给药后,偶联物的半数致死量 LD。。明显大于 PLL和 ACV的 LD;。,表明 Lac干LL个CV合成后能明显降低游离ACV的急性毒性。结论认为乳糖化多 聚赖氨酸作为肝去唾液酸糖蛋白受体介导的一种药物载体,能使ACV获得 较满意的肝靶向性。


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