大劣按蚊黑化包被约氏疟原虫免疫机理的研究

【摘要】： 约氏疟原虫卵囊黑化是疟原虫不能在大劣按蚊体内发育成熟的主要表 型。目前推测，与冈比亚按蚊一样，大劣按蚊黑化包被约氏疟原虫可能也是 由PPO级联反应介导，但缺乏直接证据的支持。 PPO系统主要由识别/结合蛋白（recognition/binding protein）、PPO和 PPAE组成。其中，PO是PPO系统的关键成分之一，它是以酶原形式PPO 存在于昆虫体内，具有MPO和DPO两种酶活性。因此，本研究利用大劣 按蚊/约氏疟原虫为模型，通过观察感染约氏疟原虫后大劣按蚊血淋巴PO 活性变化，以及卵囊黑化期间血淋巴蛋白的表达，探讨PPO级联反应与约 氏疟原虫卵囊黑化的关系以及卵囊黑化包被相关蛋白。 PPAE是一种分子量约为30KD的丝氨酸蛋白酶，而丝氨酸蛋白酶是丝 氨酸蛋白酶级联反应的关键酶。大量研究发现，脊椎动物和无脊椎动物体内 的丝氨酸蛋白酶对调节生理活动和免疫反应都具有重要作用。因此，本实验 克隆了AdsP，为进一步研究其在按蚊黑化包被反应中的调节作用打下基础。 另外，还克隆了大劣按蚊S7，拟作为观察感染疟原虫后AdsP转录的内参照。 选择3-5日龄的雌大劣按蚊，分成不吸血组、吸正常血组和约氏疟原虫 感染组。首先，经非变性PAGE分离后，采用酶底物显色方法，鉴定并测 定了血餐后d_5、d_7、d_(11)和d_(15)三组雌大劣按蚊血淋巴MPO和o-DPO酶活性。 结果显示，感染组的血淋巴MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组和吸 正常血组（p＜0.05）；但是随着约氏疟原虫卵囊黑化比率的增高，感染组血 淋巴MPO和DPO活性逐渐下降，尤其以d_(15)最为明显。 吸血感染后d_1、d_3、d_4和d_5分别收集三组雌大劣按蚊血淋巴，经SDS- PAGE分离后，银染显色。以不吸血组和吸正常血组为对照，结果发现，感 染组的雌大劣按蚊部分血淋巴蛋白表达增强，而部分蛋白表达却减弱。 用烟草天蛾（Manduca Sexta）的PPO1 IgG检测正常雌大劣按蚊血淋巴 PPO组成，发现大劣按蚊血淋巴 PPO有 87、67、63KD三条蛋白带，而感 染组中相应分子量的三条蛋白带在山时开始表达增强。 根据己报道昆虫的丝氨酸蛋白酶保守氨基酸序列设计简并引物，以大 劣按蚊血细胞cDNA为模板，进行PCR扩增，目的片段进行T／A克隆、测 序，首次获得三种大劣按蚊血细胞丝氨酸蛋白酶 CDNA序列，AdSP、AdSPZ 和AdsP3。BLAST查询结果显示，AdsPI 与冈比亚按sP14DI、sP14DZ、 Holotrichia diomphalia PPAE－I和果蝇（Drosophil）Easter很相似；AdsPZ与 冈比亚按蚊 SPZA最相似；而 AdSP3与冈比亚按蚊 SP 4A有很高的同源性。 资料显示，SP 4A、sP 4D和 sP 4D2可能是冈比亚按蚊的 PPAE，因此， 椎测 AdsP和 AdsP3是大劣按蚊的 PPAE，可能调节黑化包被反应。 同时，根据烟草天蛾、人、鼠和冈比亚按蚊的S7 mRNA序列，设计一 对简并引物，克隆并测定大劣按蚊S7cDNA部分序列。Blast查询发现，其 与人、鼠、冈比亚按蚊和烟草天蛾S7均有非常高的同源性。 上述结果提示，PPO级联反应可能介导了大劣按蚊黑化包被约氏疟原 虫反应，而且可能在山或更早期被激活；而卵囊黑化期间诱导的大劣按蚊 血淋巴蛋白在一定程度上与PPO级联反应主要成分相关。另外，BLAST结 果提示 AdsP和 AdsP3可能是大劣按蚊的 PPAE，可能调节大劣按蚊的黑 化包被约氏疟原虫反应。