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Notch信号在体外牙髓细胞分化中的表达及其调控的实验研究

何飞  
【摘要】: 牙髓组织损伤修复机理是牙髓生物学研究的热点问题之一,而其中最 重要的环节——牙髓细胞向成牙本质细胞的分化,更是备受口腔临床医生 和科研工作者关注。目前研究多集中于一些与细胞分化有关的生长因子和 胞外基质分子,如BMP、NCPs、FN、TGFβ超家族成员等。这些信号分 子互相协同,形成一个复杂的网络,与细胞表面受体结合调节成牙本质细 胞的基因表达、细胞骨架重排,使细胞出现极化和功能分化,参与牙髓组 织损伤修复。但这些分子只能提供诱导细胞分化的信号,众所周知,细胞 的分化还与组织中各种细胞对信号分子的反应性及细胞间相互作用有关。 那么,在牙髓损伤修复过程中,机体是通过什么途径控制牙髓细胞对这些 信号分子的反应性,从而实现向成牙本质细胞分化的呢? Notch信号途径正是一种控制前体细胞对特殊信号反应的机制。研究 证明,Notch信号可影响胚胎发育过程中多种细胞(如神经细胞、淋巴细胞、 上皮细胞等)的分化、增殖和凋亡,通过其介导的侧向分化和信号诱导作用 实现对相邻细胞命运的控制,在多细胞动物发育的细胞分化中起中心作用。 有研究显示:Notch信号途径在牙齿发育中也具有重要作用,与成釉细胞 和成牙本质细胞分化有关,认为牙齿发育中细胞的多样性依赖于Notch信 号介导的侧向分化作用。另外,多种与成牙本质细胞分化有关的生长因子 经证实可影响体外培养的牙胚间充质细胞Notch信号成分的表达。最近, Mitsiadis等观察到牙髓损伤后早期(24—48h)有Notch受配体的表达升高。 因成年组织的损伤修复与胚胎组织发育中的细胞分化过程有一定的相似 性,因此有人推测Notch信号途径在成年组织损伤修复过程的细胞分化中 也起作用。但目前对Notch信号在牙髓组织损伤修复中的作用,尤其是在 牙髓细胞向成牙本质细胞分化中的作用知之较少,亦未见进一步文献报道。 由于牙髓被牙体硬组织包围,体内研究存在许多困难,因此体外培养 牙髓细胞对于探索和揭示牙髓组织活动是重要而且必要的。近年来的研究 发现,某些体外培养的牙髓细胞具有成牙本质样细胞的一些特性,提示体 外培养的牙髓细胞在一定的条件下可分化为成牙本质样细胞,这与牙髓损 伤修复中的牙髓细胞增殖、分化过程有很大的相似性。 在此基础上,本研究以体外人牙髓细胞连续培养分化、钙化过程作为 研究体内牙髓组织损伤修复中牙髓细胞增殖、分化的体外模型,对体外人 牙髓细胞增殖、分化、钙化过程中NotchZ及其配体Delta的表达进行了研 究,探讨N川Ch信号在牙髓细胞向成牙本质样细胞分化中的作用;并进一 步在连续培养系统中加入rhBMP一一种重要的参与牙髓损伤修复的因 子,检测其对N。t。h信号成员表达的影响,探索信号分子与N。tCh信号表 达的关系,从信号分子的诱导和细胞对信号的反应性两个方面探讨牙髓损 伤修复的机理,从而为临床保存活髓治疗打下理论基础。 方法: 本研究分三个部分进行:以体外连续培养分化、钙化的人牙髓细胞为 研究对象,首先利用酶动力学法、光镜、电子显微镜、钙质染色等方法对 其生物学特性进行研究,确定我们所培养的牙髓细胞能否向成牙本质样细 胞分化,从而判定此连续培养系统是否可作为研究牙髓损伤修复细胞分化 的体外模型;第二步用酶动力学法、MTT比色法研究rhBMPZ对连续培养 的人牙髓细胞生物学特性的影响,并通过制作大鼠牙髓损伤惨复模型,以 兔疫组织化学方法检测体内外牙髓损伤修复过程中BMPZ的表达;在此基 础上,第三步用兔疫组织化学、Western blot等方法对体外人牙髓细胞增殖、 分化、钙化过程中Notch。及其配体Delta的表达进行定性及半定量研究, 从它们的表达部位及表达水平变化探讨N。tch信号途径在牙髓细胞增殖、 分化中的作用,并通过对培养系统中加入的山**PZ对N饥吮信号成员表 达影响的研究,探讨NOtCh信号途径与信号分子rhBMPZ的关系。从信号 分子的作用及细胞对信号的反应性角度探讨牙髓损伤修复的机理。 VI 结果: l.体外连续培养10天左右部分人牙髓细胞出现复层生长,约15天形 成细胞结节,约30天结节中央部可出现黑色沉积物,钙质染色为 阳性;牙髓细胞具有较高的碱性磷酸酶活性,胞浆内有1型胶原的 表达:透射电镜观察其超微结构特征与成牙本质细胞相似。 2.大鼠牙髓损伤修复过程中有BMPZ的表达升高,主要位于成牙本质 细胞层及穿髓点下方的牙髓细胞;体外连续培养的牙髓细胞在第 15天左右出现 BMPZ的表达;rhBMPZ可促进培养的人牙髓细胞的 增殖,与其本身浓度有关,并可提高人牙髓细胞ALP活性,呈浓 度依赖性。 3.在体外牙髓细胞增殖、分化及钙化初期均有NotchZ及其配体Delta 的表达,随细胞增殖、分化的状态不同,二者表达的强度和部位也 发生变化。 4.细胞结节形成后期rhBMPe可使Delta的表达上调。 结论: 1.牙髓细胞在连续培养过程中可分化为成牙本质样细胞,此连续培养


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