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呼吸道合胞病毒M2-1基因表达载体的构建及M2-1蛋白多克隆抗体的制备

辛庆红  
【摘要】: 呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)已被公认是引 起婴幼儿下呼吸道感染的致病原。近年来,有关RSV引起成年人感染 尤其是老年人、无免疫应答和心肺疾病患者感染的报道增多。尽管RSV 免疫球蛋白和F、G单克隆抗体治疗RSV感染以及疫苗免疫取得了一 定的效果而成为研究的热点,但RSV感染尚缺乏有效的治疗。 陈杭薇等利用RT-PCR的方法从原发性肺癌手术标本中扩增出RSV N基因片段,这一发现提示RSV与肺癌存在着一定的关系,是潜在感染 还是与肺癌的发生发展有关尚不清楚。 M2-1基因是比较保守的基因,M2-1蛋白是RSV包膜和衣壳相关 蛋白。最近研究发现M2-1蛋白具有RSV mRNA转录延长的作用,是 RSV基因连接处转录通读不可缺少的因子,对RSV的转录起着非常重 要的作用,因此,其对RSV的繁殖起着重要的调控作用。 国外对RSV的研究比较多,但其与肺癌的关系尚未见报道。国内 对RSV的研究相对薄弱,对RSV M2-1基因的研究亦无报道。M2-1基 因作为RSV的一个重要基因,对RSV的生物学行为起着重要的作用。 构建M2-1基因表达载体及制备M2-1多克隆抗体,有助于阐明RSV M2-1 基因及其蛋白的功能及其与肺癌的关系,也为RSV的被动免疫及疫苗 免疫研究开拓新的领域。 本研究的目的:1 构建M2-1基因表达载体;制备M2-1多克隆抗 体,为深入研究M2-1基因蛋白的生物学功能及其与肺癌的关系奠定基 础。2 建立RT-PCR克隆M2-1基因的方法;以便进一步探讨M2-1蛋 白及其多克隆抗体应用于临床检测RSV的可行性。3为研究MZl基 因及其蛋白疫苗开辟前期工作。 方法:1.培养RSV,提取细胞总RNA,用RTICR的方法扩增 MZ1。2.提取质粒 pGEX毛,pGEX上 与 MZ八 均经过 ECORI和 XhOI酶切,然后进行连接,连接产物转化至 BL上 大肠杆菌 中。3.利用PCR和酶切的方法筛选阳性重组子,最后MZq基因测序 以确定正确的阳性重组子。4.在MZd基因原核表达载体的基础上,构 建MZl基因真核表达载体。5.诱导及纯化MZ一蛋白。6.制备MZl 蛋白多克隆抗体。 结果:1.RTICR产物凝胶图象仪观察,可见约620hp条带,对照 为阴性。2.PCR筛选原核阳性重组子,凝胶图象仪舰察,可见约620hp 条带。3.原核阳性重组子双酶切,凝胶图象仪观察,可见约620hp条 带。4.MZq基因测序u)发现16个密码子同义突变,7个密码 子错义突变。5.PCR筛选真核阳性重组子,凝胶图象仪观察,可见 620hP的条带,对照为阴性。6.真核阳性重组子双酶切,凝胶图 象仪观察,可见约620hP条带。7.MZ上蛋白诱导及纯化,凝胶图象仪 观察,可见48KD的蛋白条带。8.MZ1蛋白多克隆抗体的制备,Western hi川检测,可见特异性较强的4 8 K D的条带,E LIS A检测抗体效 价为 1:10 24(l:2‘’)。 结论: 1.建立了R T—P C R克隆MZ—l基因的方法。 2.构建了MZ—l基因原核与真核表达载体。 3.实现了MZ一二 基因蛋白的表达,获得了纯化的MZ—1 融合蛋 白。 4.制备了MZ—l融合蛋白多克隆抗体。 5.为深入研究RSV MZ1基因蛋白生物学功能及RSV与肺癌的关 系奠定了基础;为进一步应用MZ-1蛋白及其单克隆抗体临床检测RSV 提供了分子生物学新途径:为研究*2l基因及蛋白疫苗开辟了前期工 ,。Vll” 作。


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