重组人诱导型一氧化氮合酶在V_79细胞中的稳定表达及其对平滑肌细胞增殖的影响

【摘要】： 背景：一氧化氮（nitric oxide，NO）是血管内皮细胞分泌的一种重要的 舒血管因子。NO不仅是机体的一种重要的信使分子，它还具有促内皮生 长，抑制血小板和白细胞在血管表面聚集，抑制平滑肌细胞增殖、迁移， 在胶原合成和分泌其它细胞因子等方面也起调节作用。多种血管损伤性疾 病，如动脉粥样硬化、高血压和再狭窄，与内皮功能不足和一氧化氮分泌 减少有关。促进受损内皮再生，恢复血管周围NO的保护性功能，在治疗 这些疾病中具有重要意义。已有研究用病毒载体将NOS基因经血管腔进 行转染，通过外源基因的表达，增加损伤血管局部NO的分泌，以达到治 疗血管损伤性疾病的目的，并已在动物实验中取得了良好的治疗效果。但 病毒载体进入机体可以引起致命的免疫反应和急性炎症反应，限制了其在 临床中的广泛应用。用脂质体将NOS基因从血管外膜进行基因转染，这 方面的研究较少报道。本实验研究借用对血管内皮细胞（vascular endotheliocyte，VEC）重要功能之一的NO、NOS研究较深入的基础作为 突破点，通过转基因技术将诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）基因转染至生物特性与VEC有很大差异的血管壁非内皮 细胞成份上，使iNOS表达具有生物活性的基因产物，从而提出血管生物 学的新概念：动脉血管壁非内皮细胞成份在成功转染和表达iNOS基因 后，转基因产物的生物作用可行使VEC相应的功能，开拓减轻或逆转由 VEC功能不全或丧失所致相关疾病治疗的新途径。作为前期的基础性研 究，我们将iNOS基因转染至V_(79)成纤维细胞中，观察iNOS的表达和NO 生成量，研究转染生成的NO对血管平滑肌细胞增殖的影响，既探讨了外 源性iNOS基因转染成纤维细胞的可行性和具有转iNOS基因的成纤维细 胞对血管平滑肌的生物行为的影响，又进一步为VEC功能不全或丧失的 血管转染iNOS提供了实验研究的依据。 方法：＊）真核表达载体pCDNA3－iNOS的构建：真核表达载体pCDNA。 和 iNOS CDNA目的片段分别用 Hilld Ill和Xbll双酶切，T。DNA连接酶 将iNOS片段和线性化的pCDNA。连接，用酶切和碱基序列测定进行重组 体的鉴定。c用脂质体介导的基因转染方法，将PCDNA厂iNOS导入V” 细胞中，筛选G。；／性克隆，扩大培养获得稳定表达iNOS的V，。细胞系。 通过RT－PCR检测转染细胞中oOS mRNA的转录，Western Blot检测转 录生成的oOS蛋自酶，兔疫荧光染色进一步定位检测转染细胞分泌的 iNOS蛋白。＊用Gness 法测定细胞培养基上清中NO的代谢产物NO。“含 量，以反映转染细胞生成的NO量，并观察H4B对NO生成的影响O）将 转染iNOS的V，9细胞上清制备成条件培养液加到平滑肌细胞中，通过生 长曲线和细胞周期分析，观察NO对平滑肌细胞增殖的影响。 结果：1重组质粒通过酶切鉴定和碱基序列测定证实了iNOS CDNA定 向插入到真核表达载体中。pCDNA广iNOS含有真核表达的巨细胞病毒强 启动子和新霉素磷酸转移酶neo基因，可用于真核细胞的转染。 2．RT－PCR检测转染pcDNA。一NOS的V，。细胞中有iNOS mRNA的转录， Western blot结果显示转染的细胞中有iNOS蛋白的表达，兔疫荧光染色 观察到转染细胞分泌的iNOS的蛋白存在于细胞的胞质中。而正常细胞组 和转染空质粒的细胞中未见iNOS mRNA和iNOS的蛋白的生成。 3．采用Gr i ess法测定细胞培养基上清中NO的含量。结果显示，未加 Hp时，iNOS转染组细胞NO含量明显高于正常细胞组和空质粒转染组 ①二0刀0，n＝6X正常细胞组和空质粒转染组之间NO含量无明显差异o－0．l， n畸）；加入HS后，iNOS转染组中NO含量较未加组明显增加，两者相 比具有显著性差异o刃．00，n朽），而正常细胞组和空质粒转染组与未加 H庐 组相比无明显变化o司．403，n＝6卜 4．分别将V，。正常细胞条件培养液、空质粒转染组细胞条件培养液、 ．Vll’ t／A～ ”》 iNOS转染组细胞条件培养液加入到培养的平滑肌细胞中，于加入条件培 养液后24h、48h、72h收集各组细胞并进行活细胞计数，绘制生长曲线。 其变异系数为 CV巧个 12叭n叫人 结果加入 i NOS转染组细胞条件培养液可 使VS肌增殖明显受到抑制，通过细胞周期的进一步分析，增殖受到抑制 的VSMC增殖周期发生了明显的变化，处于GG；期细胞明显增高，与对 照组相比差异显著（P二0．034，n二3），S期细胞明显减少（P二0．026，n＝＝3），G。＊ 期细胞变化不大（P＝0．73，n＝3）。 结论：1．本实验构建的真核表达载体 pCDNA广一NOS含有人 iNOS CDNA 全长序列，具有转染哺乳类细胞的通用性，可用于iNOS基因的真核表达 及调控的研究。