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锤头状核酶、反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性及细胞增殖的作用

姚伟  
【摘要】: 肺血管重构是低氧性肺动脉高压的主要特征,主要表现为肺动脉平滑肌细胞过度增殖,可能与生长因子和血管活性物质等激活细胞Na~+/H~+交换有关。Na~+/H~+交换激活后,使肺动脉平滑肌细胞在增殖早期即出现细胞内pH(pHi)明显增高,对其增殖具有容许性作用。 Na~+/H~+交换器-1(NHE-1)几乎在所有真核细胞膜均有表达,介导1:1的细胞内H~+和细胞外Na~+交换,参与调节pHi等。肺动脉平滑肌细胞膜亦有NHE-1表达,在低氧条件下表达明显增高,其特异性抑制剂可明显抑制肺动脉平滑肌细胞增殖。因此本实验通过将NHE-1特异性锤头状核酶和反义RNA体外转染肺动脉平滑肌细胞,并检测细胞中NHE-1表达、Na~+/H~+交换活性、pHi的变化,及其与细胞增殖变化的关系,探讨NHE-1在肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用。 研究内容包括: 1.根据大鼠NHE-1mRNA序列,设计并合成两条锤头状核酶,应用PCR方法扩增获得反义RNA序列;并将其分别克隆于反转录病毒载体pLXSN的多克隆位点中。 2.采用FuGENE6转染试剂将重组载体转染入培养的肺动脉平滑肌细胞。RT-PCR方法检测NHE-1mRNA表达。 3.检测转染细胞pHi变化,~(22)Na摄取量的改变。检测诱导细胞酸化后pHi恢复速率,不同细胞外Na~+浓度下pHi恢复速率等Na~+/H~+交换活性指标变化。检测~3H-TdR掺入量等细胞增殖指标的变化。 4.检测细胞在10%血清、PDGF和EGF作用后,pHi和~(22)Na摄取量变化;Na~+/H~+交换活性指标及~3H-TdR掺入量的变化。 结果: l.经DNA测序和质粒酶切鉴定,证实核酶和反义RNA的反转录病 毒重组载体构建成功。转染细胞经 100vg/inl浓度G418筛选后获得带有 转染质粒的阳性细胞克隆。RTP*R和2*R方法检测均有*e。基因表达,’一 表明细胞转染成功。 2.RT—PCR方法检测发现,转染核酶和反义RNA重组载体的细胞中 NHE上 表达明显低于正常细胞和转染空载体细胞。其pHi亦较正常 细胞明显下降,pHi恢复速率降低,nNa摄取量和3H1dR的掺入量减少。 3.与正常细胞相比,转染重组载体的细胞在10%血清、PDGF和 EGF 作用后 10分钟,pHi增高幅度明显下降。作用后 24 ’J\时,其 pHi与干预 前无明显变化。10%血清、PDGF和EGF作用后24小时,转染重组载体~ 细胞 pHi恢复速率、‘ZNa摄取量及‘H1dR掺入量均明显低于正常细胞; 但与干预前相比,3H1dR掺入量有不同程度的增加。 结论: 1.本实验成功构建了大鼠NHE-l特异性锤头状核酶和反义RNA的反 转录病毒载体,并成功地转染人培养的肺动脉平滑肌细胞内。 2.所设计的NHE-l锤头状核酶和反义NA可使肺动脉平滑肌细胞中 NHEq 的表达、N/月了“交换活性明显下降,pHi降低,细胞增殖受一 到显著抑制。 3.血清、PDGF和EGF可通过激活肺动脉平滑肌细胞NHE-l,使细 胞pHi明显增高,N见交换活性增强,促进细胞增殖。 4.所设计的NHE-l锤头状核酶和反义RNA能够使肺动脉平滑肌细胞 对血清、PDGF和EGF的反应性降低。 从而明确了NHE-l在肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用,并为进一步应。 用反义技术进行低氧性肺动脉高压的基因治疗提供了一定的实验基础。


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