吡那地尔预处理对内毒素血症保护效应及其机理的实验研究

【摘要】： 大量研究表明预适应(preconditioning,PC)为预先给予机体或细胞某种有害刺激，当再次暴露后可产生对该种有害刺激的耐受性反应，是机体的一种保护性效应。在缺血预适应研究中发现有许多药物可以模拟其作用达到预适应的目的，如K_(ATP)通道开放剂吡那地尔(Pinacidil)、Nicorandil、Bimakalim、Aprikalim等可模拟缺血预适应对心肌具有保护作用，也称为药理性预适应(pharmacologic preconditioning)。内毒素耐受性(endotoxin tolerance,ET)为内毒素血症的PC过程，其机理与缺血预适应相类似，两者存在着交叉耐受性(cross-tolerance)。研究发现脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、单磷酸类脂质A(monophosphoryl lipid A, MLA)等可产生ET,也可以减轻缺血/再灌注对心脏、肝脏、肾脏的损伤，基于此思路，本实验首次用可模拟缺血预适应的Pinacidil预处理动物及细胞，观察对内毒素血症的预保护作用及其作用机理。 首先本课题在验证Pinacidil对内毒素血症有无预保护作用的基础上，以K_(ATP)通道关闭剂Glyburide为工具药，针对内毒素血症致死的主要机制，观察Pinacidil预处理对内毒素血症时血液凝血机制的影响，对内毒素血症细胞因子产生及其信号转导调控机制的作用，以及在Pinacidil预处理后对中性粒细胞呼吸爆发的影响，主要的结果及结论如下： 1．Pinacidil预处理后内毒素血症小鼠生存率明显增加，Glyburide可以拮抗Pinacidil的作用，使生存率与未治疗组相差不明显。内毒素血症大鼠表现为代谢性酸中毒伴呼吸性酸中毒，高钾血症及低钠、低氯的、低钙血症；Pinacidil预处理后加重代谢性酸中毒，减轻呼吸性酸中毒，有加重大鼠内毒素血症后高钾血症及低钠、低氯、低钙血症的作用，Glyburide可部分阻断 第三军医大学博士研究生论文 毗那地尔预处理对内毒素血症保护效应及其机理的实验研究 Pinacidil的作用。表明Pinacidil对内毒素血症有药物预保护作用，但对于内 毒素血症所引起的代谢紊乱无明显作用。 2．用沉淀法对大鼠血液凝血因子＊、V、VIJ、X及纤维蛋白原含量研究 发现，Pinacidil预处理可使内毒素血症时凝血因子。11、V、皿、X减少滞后， 在各时相点均使纤维蛋白原量明显高于LPS组，Glyburide对Pinacidil有明 显的桔抗作用。此结果表明Pinacidil预处理可使内毒素血症凝血作用启动 晚，血液中微血栓形成较少，可减轻内毒素导致的凝血功能亢进的作用。 3．用ELISA法检测大鼠血液细胞因子IN’－－－－、、IL－6含量显示，Pinacidil预 处理使内毒素血症TN’－－－0、u－6含量明显降低；在用LPS攻击人单核细胞株 M－l时也发现，Pinacidil预处理可使M－l生成IN’－－、、IL6明显减少， Glyburide对Pinacidil预处理有明显的桔抗作用，表明Pinacidil预处理使SIRS 反应中单核／巨噬细胞生成细胞因子MO、IL6减少，继而降低血液中M－。。 IL6含量，减轻SIRS反应。 4．本文用流式细胞仪研究THP．l细胞膜表面抗体标记的hR4时发现，在 LPS的攻击下，LPS跨膜受体’－WWx的表达呈可诱导性表达；我们首次发现在 不同浓度的L陀刺激下，Phuldn预处理使Te－1细胞膜表面TLR4表达 量明显降低；在用 ELISA法研究核内 NF－K Bty65）表达量时也显示，Pinacidil 预处理使不同浓度 LPS刺激后 NF－。Bio65）表达量降低，Glyburide对以上 反应均有桔抗作用。由此说明Pinacidil预处理可下调LPS跨膜信号转导过 程，导致 M4 Bio65）表达下调，最终使 LPS诱导细胞因子生成的级联反应 降低，因此对SIRS反应具有预保护效应。 5．在研究中性粒细胞呼吸爆发和细胞内K 变化时结果显示，Pinacidil 预处理使 LPS攻击后胞内游离＊a2＋］升高程度明显降低，并使中性粒细胞在 PMA刺激下呼吸爆发明显减弱，Glybchde明显桔抗Pinacidil预处理的作用。 因此Pinacidil预处理可抑制中性粒细胞呼吸爆发作用，减少氧自由基生成， 减轻对器官和细胞的损伤。 综上所述，Pinacidil预处理对内毒素血症具有药理性预适应效应，其 作用机理为减轻LPS导致的凝血功能亢进，下调LPS跨膜信号转导过程并 Vll ／ 第三军医大学博士研究生论文 毗那地尔预处理对内毒素血症保护效应及其机理的实验研究 使SIRS反应减轻，降低中性粒细胞呼吸爆发作用。本实验拓宽了药理性预 适应在内毒素血症中的研究思路，为临床脓毒症／感染性休克的预防和保护 性治疗提供了新手段，同时也为KAT，通道参与调节跨膜信号转导过程的基 础研究