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Caspase-3在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及药物干预研究

徐强  
【摘要】: 目的:心肌缺血再灌注损伤(IRI)是制约急性心肌梗塞患者从成功的再灌注疗法中获取最佳效益的主要因素之一。再灌注损伤的发生机制至今仍未阐明,近年来许多研究发现凋亡参与了心肌缺血再灌注损伤,caspase-3是细胞凋亡完成过程中最重要的调节因素之一。为此,本课题利用大鼠心肌缺血再灌注模型,研究凋亡在心肌缺血再灌注损伤中的作用并利用caspase-3抑制剂进行干预治疗,以评价干预对细胞凋亡及缺血再灌注损伤的影响并探讨其作用机制;为临床制定抗心肌缺血再灌注损伤决策提供理论和实验依据。 方法:Wistar大鼠132只,随机分为单纯缺血再灌注组、缺血再灌注+Ac-DEVD-CHO治疗组和假手术对照组。各组分设缺血30min后再灌注1h、3h、6h、12h及24h五个时相点;对照组只设12h一个时相点作总体对照。另用50只大鼠随机分为缺血再灌注组和缺血再灌注+Ac-DEVD-CHO治疗组,每组5只,时相点设置同前述,行TTC染色测定心肌梗塞范围。治疗组于再灌注开始时通过颈内静脉导管注射caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO3.0 mg/kg。测定梗塞范围和心肌组织形态学变化,以其变化作为心肌缺血再灌注损伤程度的标志;用TUNEL法测定心肌细胞凋亡,用荧光分析法检测caspase-3活性,用S-P免疫组化和Western blot测定Fas基因蛋白表达量,同时测定中性粒细胞浸润数量;并分析各指标间的相互关系及与心肌IRI程度的关系。用caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO进行干预治疗,以评价其对心肌细胞凋亡的影响和对缺血再灌注心肌的保护效果。 结果:(1) 心肌细胞凋亡指数随再灌注时间延长而呈渐增趋势,于再灌注12h达高峰,至再灌注24h仍保持较高水平。Ac-DEVD-CHO治疗组,心肌细胞凋亡指数变化规律与IR组相类似,虽然各时相点均高于对照组, WP=8 但与IR组比较则显著减少。(2)心肌梗塞范围随缺血再灌注时间增加而逐渐增加,至24h仍未见下降趋势, 心肌细胞凋亡指数与心肌梗塞范围之间呈显著正相关。Ac-DEVD-CHO治疗组,缺血再灌注早期变化与IR组相类似,但再灌注12h后坏死区增加趋势较IR组减缓。心肌梗塞范围除再灌注1h之外,其余各时相点均较IR组显著缩小。(3) 大鼠心肌细胞caspase-3活性在缺血再灌注后1小时即明显升高,于再灌注12小时达到高峰后基本维持平台状态,心肌细胞凋亡指数与caspase-3活性之间呈显著正相关。Ac-DEVD-CHO组,相应时相点caspase-3活性与IR组比较均显著减小。(4) 心肌细胞Fas蛋白表达随再灌注时间延长而呈渐增趋势,再灌注6h达高峰,其后维持在较高水平。Ac-DEVD-CHO治疗组,变化趋势同IR组,且各相应时相点两组间比较无明显差异。(5)大鼠心肌PMNs浸润数随缺血再灌注时间推移而成进行性增加,再灌注24小时仍未见下降,心肌细胞梗塞范围与中性粒细胞浸润数之间呈显著正相关。Ac-DEVD-CHO治疗组,变化趋势同IR组,但相应时相点两组间比较则明显减少。 结论: 1. Caspase-3参与了缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡过程,且心肌细胞凋亡是缺血再灌注损伤所致细胞死亡的重要组成部分。 2. 心肌缺血再灌注时用Ac-DEVD-CHO干预后,缺血区心肌组织PMNs浸润数明显下降,说明其心肌保护机制与抑制中性粒细胞浸润等炎性反应有关。 3. 用caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO干预不能使Fas蛋白表达量下降,提示Fas作用位点处于凋亡信号传导通路上的上游。 4. Ac-DEVD-CHO可通过抑制caspase-3活性而改善缺血再灌注损伤,为抗缺血再灌注损伤提供了一个新途径。


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