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GRKs参与大鼠急性肺损伤发生机制的实验研究

肖贞良  
【摘要】: 为研究G蛋白偶联受体激酶(GRKs)参与急性肺损伤(ALI)发生的机制,本课题在用大肠杆菌脂多糖(LPS)建立内毒素性ALI大鼠模型的基础上,采用Western blot观察了内毒素性ALI大鼠肺组织GRK2、GRK3在蛋白水平表达的变化和山莨菪碱的干预作用。本课题还在体外成功分离、培养了大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)的基础上,采用Western blot分别观察了LPS、TNFα作用后PMVEC中GRK2、GRK3在蛋白水平表达的改变和山莨菪碱的干预作用;用RT-PCR法观察了LPS作用后大鼠PMVEC中GRK2、GRK3、β-arrestin1和β-arresti2在mRNA水平表达的改变和山莨菪碱的干预作用;分别用fura-2/AM和放射免疫法观察了LPS、TNFα作用后PMVEC细胞内钙离子([Ca2+]i)、cAMP改变和山莨菪碱的干预作用。本研究结合我们既往的工作主要探讨:(1)内毒素性ALI大鼠肺组织GRKs变化与β-肾上腺素能受体(AR)下调之间的关系;(2)LPS、TNFα作用后大鼠PMVEC GRKs、β-arrestins变化与β-AR下调之间的关系;(3)LPS、TNFα作用后大鼠PMVEC [Ca2+]i 、cAMP变化与β-AR下调及肺微血管内皮损伤之间的关系。 结果:(1)Western blot检测大鼠肺组织GRK2蛋白表达发现,与正常对照组比较,LPS组、LPS+山莨菪碱组杂交带GRK2含量显著增高;LPS组与LPS+山莨菪碱组杂交带的GRK2含量比较无显著差异。Western blot检测大鼠肺组织GRK3蛋白表达,结果重复3次均为阴性。(2)Western blot检测大鼠PMVEC GRK2蛋白表达结果发现,与正常对照组比较LPS组和LPS+山莨菪碱组杂交带的GRK2含量显著增高; TNF(组和TNF(+山莨菪碱组杂交带的GRK2含量也较正常对照组显著增高。Western blot检测大鼠PMVEC GRK3表达,结果重复3次均为阴性。SDS-PAGE发现大鼠PMVEC蛋白裂解液电泳结果缺乏GRK5、GRK5蛋白带。(3)RT-PCR检测大鼠PMVEC GRK2 mRNA表达结果发现,LPS组和LPS+山莨菪碱组GRK2 mRNA表达较正常对照组显著增高;LPS组、LPS+山莨菪碱组和正常对照组均未检测到有GRK3 mRNA表达。(4)RT-PCR检测大鼠PMVECβ-arrestin1、β-arrestin2 mRNA表达结果发现, LPS组和LPS+山莨菪碱组β-arrestin1、β-arrestin2 mRNA表达均较正常对照组显著增高。(5)与正常对照组比较,LPS组和LPS+山莨菪碱组15min和90min两个时相点大鼠PMVEC WP=7 [Ca2+]i均显著升高; TNFα组和TNFα+山莨菪碱组15min和90min两个时相点[Ca2+]i也较正常对照组显著升高。(6)正常大鼠PMVEC细胞内cAMP浓度为0.473±0.054μμmol /40μl。LPS组和LPS+山莨菪碱组15min、90min两个时相点大鼠PMVEC细胞内cAMP浓度显著高于正常对照组。TNFα组和TNFα+山莨菪碱组,15min和 90min两个时相点细胞内cAMP浓度也显著高于正常对照组。 结论:(1)大鼠肺组织表达GRK2,但不表达GRK3。(2)大鼠PMVEC表达GRK2,但不表达GRK3、GRK5和GRK6。(3)内毒素性肺损伤大鼠肺组织GRK2表达增高,可能是导致内毒素性肺损伤大鼠肺组织β-受体内化和失敏的主要原因之一。(4)LPS可诱导大鼠PMVEC GRK2在mRNA和蛋白水平表达增高;TNFα可诱导大鼠PMVEC GRK2在蛋白水平表达增高。GRK2表达增高可能是LPS和TNFα作用后大鼠PMVEC β-受体内化,并表现为受体下调的主要原因之一。(5)LPS可诱导大鼠PMVECβ-arrestin1、β-arrestin2 mRNA表达增高,这可能也是LPS作用后促使大鼠PMVECβ-受体内化,并表现为受体下调的主要原因之一。(6)LPS和TNFα作用后大鼠肺微血管内皮细胞[Ca2+]i浓度和cAMP浓度升高的机制可能与β-受体介导的信号转导通路无关。


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