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早期人胎肝细胞乙型肝炎病毒感染相关分子的探索研究

汤勃  
【摘要】: 乙型病毒性肝炎(hepatitis B,乙型肝炎)是危害我国人民健康最严重的疾病之一,我国携带HBsAg的总人数超过1亿人。虽然已有相关疫苗和众多药物,但5%~10%的人群对现有乙型肝炎疫苗反应低下,且药物疗效难以令人满意。近年来公共卫生环境的改善,虽然使乙型肝炎的水平传播及围产期传播明显下降,然而乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)宫内感染尚无有效预防手段,且宫内感染一旦发生,出生后大多进展为慢性乙型肝炎而持续携带,严重危害个体及其周围人群的健康。此外,约5%~10%人群对疫苗不产生有效应答,在相当长的一个时期内,HBV感染人将持续存在。因此,研究HBV感染的分子机制,是寻找更加有效的疫苗和药物,并最终攻克其防治难题的重要途径。 一般认为,HBV和其他病毒类似,需要通过宿主细胞表面的受体或类似结构,进入细胞并进行自我复制。HBV受体的探索虽然已经有近20年的历史,先后发现10余种可能的蛋白质,但均未获得广泛承认。一方面表明受体研究方法仍需改进,其次提示参与HBV入侵靶细胞的分子可能不止一个。乙型肝炎的宫内感染同样涉及HBV受体问题,其机制虽不明确,胎肝细胞仍是HBV的主要靶细胞。已知乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性的母亲孕早期(first trimester,0~12周)宫内感染罕见,而孕中晚期感染率显著升高。提示早期胎肝细胞由于分化程度低,未能表达HBV受体而不易感,随孕期延长而向成人肝细胞表型逐渐分化,其间表达了HBV受体分子,导致HBV入侵定植而发生宫内感染。 基于上述假设,我们设计了10种培养条件,在自行设计的无血清培养基中添加不同的细胞分化诱导物,包括表皮生长因子、肝细胞生长因子、二甲基亚砜、苯巴比妥钠、全反式维甲酸等,分离孕10周龄人胎肝细胞进行原代培养,观测肝细胞形态及功能指标变化,并定时给予HBV感染,观察能否在体外诱导胎肝细胞出现HBV易感性;为检测肝细胞内HBV 共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA),我们改进了现有的PCR检测法。在上述实验的基础上,建立了双重削减策略,以抑制性削减杂交对比HBV易感性出现前后的细胞mRNA变化,从而筛选出与HBV感染 WP=8 有关的基因序列。 主要结果如下: 1.HBV cccDNA的改良PCR检测法简便快速,敏感性及特异性均好。 参考国外文献设计了跨越HBV基因组松驰环DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)单链区的PCR引物,实验表明单纯使用此种引物,在较多反应模板的情况下将不能区分cccDNA和rcDNA。我们在PCR扩增前使用单链核酸特异性的绿豆芽核酸酶(mung bean nuclease,MBN)消化模板,发现从105~102不同数量的cccDNA模板分子经过MBN消化后,均可扩增出相应条带;而105个rcDNA样品经过MBN消化后无法扩增任何相应条带。提示MBN预处理显著提高了PCR检测HBV cccDNA的特异性。 2.适当浓度的苯巴比妥钠可以促进孕10周龄人胎肝细胞分化成熟,并诱导HBV易感性的出现。 以非灌流法分离孕10周龄人胎肝细胞,细胞活力良好;接种后微量蓖麻毒素A亚单位处理能够有效纯化肝实质细胞。以自行设计无血清培养基为基础,建立10种培养条件,发现添加2.5mM苯巴比妥钠在培养10日后,仍可以保持胎肝细胞呈典型多边形形态,在抑制了胚胎特异性基因如甲胎蛋白(AFP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)表达的同时,促进了成熟肝细胞特异性基因如白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的表达。由此提示苯巴比妥钠可诱导人胎肝细胞向成熟肝细胞表型分化。 HBV体外感染实验发现,培养基中添加苯巴比妥钠可诱导孕10周龄人胎肝细胞在培养第6日起出现HBV易感性,并保持至第10日培养结束。其他培养条件及阴性对照、空白对照均不能被HBV成功感染。 3.“双重削减”策略鉴别出HBV易感性出现前后基因表达变化。 我们在本研究的最后部分创立了双重削减策略,即实验组内检测相与驱动相之间的抑制性削减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),以及实验组和背景组之间的对比削减,实验结果发现,此种策略减少了无关新基因对实验结果判断的干扰。 重复苯巴比妥钠诱导实验表明,HBV易感性出现可能与胎肝细胞遗传背景无关;以添加苯巴比妥钠的培养组为实验组,未添加的为背景组;选择易感性出现前的培养第3日为驱动相、易感性出现后的第6日为检测相,同时以SSH检测实验组和背景组的基因变化。通过校验步骤,实验中多个关键环节的结果均符合预期;最终的SSH实验结果显示,“虚拟”对照削减成功显示出预知的条带,且明显减少了驱动相和检测相之间相同基因cDNA的数量。 两组差异基因T/A克隆效率分别为97%和94%,随机挑取96个白色克隆,扩增插入片段后点膜建立4个cDNA阵列膜,分别以4种探针杂交,在背景组中鉴别出3个差异克隆,在实验组中鉴别出7个差异克隆。测序后获得10个不同的人类蛋白质基 WP=9 因,根据既往国内外有关研究结果进行简单筛选,发现其中蛋白酶体酶26s亚单位、血清粘蛋白和D-钙粘蛋白前体最有可能与HBV感染人胎肝细胞有关。 本课题创新点: 1. 改良了HBV cccDNA的PCR检测法,明显提高了其特异性。 2. 自


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