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维甲酸诱导HL-60细胞分化相关蛋白的鉴定及其蛋白功能的初步研究

牟芝蓉  
【摘要】: 诱导分化和/或凋亡疗法是一种新的、有前途的肿瘤治疗方法。经典的例子是用全反式维甲酸(ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(APML),ATRA的治疗对该种疾病可达92-95%的病人完全缓解。HL-60是研究APML的细胞模型。HL-60细胞对维甲酸的分化反应与原代APML细胞相似,而且APML的维甲酸临床实验基本上是基于体外HL-60细胞的实验结果。以前的研究表明,维甲酸可调节多种基因的表达产生复杂的生理和药理作用。虽然对ATRA的作用机制有一定了解,维甲酸所调节的多种基因通过RT-PCR,Western blotting,差异显示和cDNA微阵列的方法也进行了研究。然而细胞内mRNA的信息还不能代表基因产物最终功能形式蛋白质的信息,mRNA的丰度不一定与最终表达产物蛋白质有直接关系,而且蛋白的异构体(isoform)和翻译后修饰也不能通过DNA的方法确定。 RA在APML治疗上的效果被认为是由于诱导分化和克隆清除。对于相关的免疫学机制,Geary SM等的研究认为维甲酸诱导HL-60细胞分化后细胞免疫刺激能力增强以及表面某些粘附分子和共刺激分子的表达上调。维甲酸作为分化疗法治疗APML的临床药物,可能的作用机理除了有利于免疫刺激的细胞表面分子的表达上调,是否还与一些细胞蛋白的表达有关?蛋白质组学研究是近年生命科学领域的热点之一。蛋白质组学的技术和方法已在细胞生长发育调节、信号转导、疾病诊断的分子标记,以及药物开发研究等多领域被广泛应用,并成为功能基因组研究的重要组成部分。用蛋白质组学技术分析维甲酸诱导分化的HL-60细胞蛋白变化,有利于理解维甲酸作用机理。为此我们用比较蛋白质组方法分析比较ATRA诱导HL-60细胞蛋白质组的变化并对部分差异蛋白点进行质谱测序鉴定。再根据蛋白鉴定结果,用RNA干扰技术对蛋白功能进行初步研究。 我们首先确定了ATRA诱导HL-60细胞分化的条件。根据NBT阳性率和细胞状态确定ATRA的使用浓度为2×10-7 mol/L,最长诱导时间96小时。接着对诱导分化96小时细胞的细胞形态、细胞周期以及体外刺激人PBMC产生杀伤性T细胞的杀伤率进行了检测,表明诱导分化细胞NBT阳性率达90%以上,部分细胞伸出突起,细胞核变小并成为肾形等多种形状,说明细胞向成熟方向分化;细胞周期检测显示S期 WP=10 细胞明显减少,G1/G0期细胞增加;体外刺激的淋巴细胞杀伤率上升,说明分化细胞的免疫刺激能力增强。 为了分析分化细胞的蛋白表达变化,用13cm pH3-10范围的IPG胶条做IEF,双向电泳分析HL-60和HR96(ATRA处理96小时的HL-60细胞)细胞蛋白表达变化,分别可检测622±66和724±51个蛋白点。在分子量约10kDa,pI4-5区域有两个蛋白特异表达于HR96分化细胞中,而未分化的HL-60细胞不表达。为了确定HL-60细胞在2×10-7 mol/L ATRA诱导条件下何时表达这两个蛋白,比较ATRA诱导不同时相点HL-60细胞蛋白的2D-E图谱发现这两个蛋白点在ATRA诱导48小时和96小时表达,而诱导0、1、2、4、6、12和24小时没有表达。用18 cm pH3-10 和pH4-7两种pH范围的IPG 胶条,增加蛋白上样量后的双向电泳图谱可以更加清晰地显示两个差异表达蛋白点。我们选择这两个重复性非常好、在ATRA诱导HL-60细胞分化96h表达的蛋白点用于蛋白鉴定。 为了鉴定在HR96细胞蛋白中表达的两个蛋白点,最初试图用Edman降解法进行N-端自动测序,但是两个蛋白点都没有出峰,可能这两个蛋白的N-端氨基酸都有翻译后修饰使N-端封闭而不能Edman降解法测序。我们用nano-ESI-MS/MS进行了进一步分析。将胶内酶切后的蛋白点样品用C18 Ziptip脱盐后置于镀金属钯的进样针中进行测定,分别筛选了5个多肽片段和4个多肽片段进行nano-ESI-MS/MS分析。经MasSeq软件对测定出的所有y离子进行序列分析,得到的氨基酸序列,通过数据库检索表明两个蛋白点属于同一种蛋白,即S100钙结合蛋白A9(S100A9),匹配肽覆盖率达44%。接着我们RT-PCR的方法检测ATRA作用不同时间的HL-60细胞中S100A9 的表达情况。实验结果表明ATRA作用24小时、48小时和96小时的HL-60细胞均可检测到S100A9特异带,而ATRA作用6小时和12小时均未检测到。RT-PCR所扩增S100A9基因片段与T载体连接后用于测序,结果与Genebank中的序列一致。 什么双向电泳图谱上明显不同的两个蛋白点为同一蛋白S100A9?是蛋白修饰还是异构体?以前的研究表明,由于翻译起始位点的不同(第5位的Met)S1001A9有一N端截断型异构体,估计分子量为12690Da。两种异构体的理论pI和分子量与2D-E图谱上用于鉴定的两个蛋白的pI和分子量基本一致。因此我们认为全长型和N端截断型的S100A9蛋白在ATRA处理的HL-60细胞中表达。 最后对S100A9在ATRA诱导HL-60细胞分化中的作用进行了初步研究。构建了表达反义RNA的pLXSA9(R)以及表达siRNA的pLNSAi-1和pLNSAi-2重组逆转录病毒载体。分别在包装细胞中形成病毒颗粒,病毒上清转染的HL-60细胞经ATRA处理后,用RT-PCR检测ATRA处理细胞S100A9的表达情况,pLXSA9(R)几乎完全抑制了S100A9的表达;pLNSAi-1和pLNSAi-2部分沉默了S100A9的表达。NBT还原 WP=11 实验表明,S100A9 mRNA表达水平与NBT阳性率部分相关性,S100A9 mRNA表达水平高的细胞NBT阳性率也较高提示S100A9在HL-60细胞分化中可能有?


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