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核小体在系统性红斑狼疮发病中的作用及其表位诱导免疫耐受的研究

郝进  
【摘要】: 系统性红斑狼疮(systemic erythematosus lupus, SLE)是一种好发于青年女性的全身性自身免疫病,可以累及机体几乎所有的器官或系统,其发病率有逐渐增加的趋势,最近一次的流行病学调查显示过去20年中,美国和欧洲的SLE发病率增加了将近3倍。目前临床常规应用的治疗方法虽然在一定程度上有效,但具有明显的毒副作用,其中对免疫系统的普遍性抑制最为突出,因此有必要探索一种可控性的免疫治疗措施来防治SLE。 SLE以血液内存在多种自身抗体为基本特征,现已明确SLE自身抗体的产生是由自身抗原驱动、依赖于Th细胞辅助的特异性免疫反应,因此可以利用基于Th细胞表位的肽耐受疫苗通过诱导机体针对特定自身抗原的免疫耐受来达到阻断致病性抗体产生的目的。该方法可高度选择性地抑制特定的淋巴细胞克隆,对机体正常免疫功能基本没有影响,也没有其他常规药物的毒副作用。肽耐受疫苗目前已经在一些自身抗原比较清楚和简单的器官特异性自身免疫病如多发性硬化症(MS)和非肥胖性糖尿病(NOD)、实验性脑脊髓膜炎(EAE)等防治研究中获得了成功,有的甚至已经进入临床研究阶段,显示了广泛的临床应用前景。和器官特异性自身免疫病不同,SLE自身抗原来源于凋亡的外周血单一核细胞(PBMC),包括胞膜、胞浆、胞核等多种成分,种类繁多,进行特异性的肽耐受研究首先必须明确其中发挥关键或重要作用的致病性抗原。 核小体是细胞凋亡过程中释放的自身抗原成分之一,是血液内DNA的重要存在形式,可以诱导产生包括ds-DNA抗体在内的多种自身抗体。近年来,在主要以狼疮鼠为对象的相关研究中,发现核小体和SLE的发病及组织损伤关系密切,提示核小体可能是参与SLE发病的重要抗原之一。但狼疮鼠的发病机制和人类显著不同,而且SLE的发病涉及多种自身抗原,抗体产生过程中存在明显的抗原或表位扩散现象,自身反应性B、T细胞之间也可能存在交叉激活,因此核小体和人类SLE的发病究竟关系如何,核小体是否作为真正的始动抗原参与SLE发病仍有待进一步探讨。本实验从临床和动物实验两方面对此做了深入研究。 WP=10 我们首先以我科确诊的SLE患者为研究对象,探讨了核小体释放水平与临床病情的关系,实验结果显示活动期SLE患者PBMC释放核小体水平明显高于SLE静止期患者和正常人对照,进一步研究表明SLE患者核小体释放水平与SLEDAI、ds-DNA抗体水平和补体C3的降低水平显著正相关,说明核小体及其诱导生成的相应抗体参与了免疫复合物的局部沉积及随后的补体活化。在随后的动物实验中,我们用连续性密度梯度离心法获得的纯化核小体皮下免疫正常BALB/c小鼠,5周后,实验小鼠的血清产生明显ANA和ds-DNA抗体,同时,实验小鼠肾脏有明显IgG型免疫复合物的沉积和炎症性损伤。核小体在没有其他抗原存在的情况下,能够单独诱导BALB/c小鼠自身抗体的产生和组织损伤,说明核小体是作为一种真正的始动抗原参与SLE自身抗体的产生和组织损伤。通过这两部分的实验结果,结合国外对狼疮鼠的研究进展,说明核小体在SLE发病和病情进展中发挥了重要或关键作用,阻断机体针对核小体的免疫病理反应有可能对SLE 的防治起到一定的作用。 核小体是真核细胞染色质的基本结构单位,是细胞凋亡过程中核酸内切酶活化后切割染色质形成的产物,完整核小体是一种由组蛋白8聚体及其表面缠绕的150bp左右双链DNA组成的大分子复合物。核小体诱导ds-DNA抗体产生过程中具有明显的类型转换、亲和性成熟等现象,另外利用亮抑肽酶、抑胃肽酶A、内体蛋白酶(endosomal protease)抑制剂、组织蛋白酶等处理APC后,可以完全阻断APC对核小体抗原的提呈,说明核小体组蛋白中含有自身反应性Th细胞相关表位。核小体分子中的蛋白成分包括H2A、H2B、H3、H4,其中H2B和H4具有较高程度的保守性,且暴露在核小体分子表面的部分相对较多。我们本实验中主要对前者的Th细胞表位进行鉴定,并以此为基础开展了肽免疫耐受研究。 根据文献报道的组蛋白H2B氨基酸组成,我们首先利用计算机软件预测了4条可能的Th细胞表位,即H2B_2~15 、H2B_14~28 、H2B_61~76和H2B_99~113,然后进行确切的表位鉴定实验。结果显示,H2B_14~28能够强烈诱导该BALB/c小鼠的Th淋巴细胞增殖和IL-2释放,且与肽浓度有明显剂量依赖关系,提示该肽是H2B的Th细胞免疫优势表位之一,进一步的分析表明,H2B14~28氨基酸序列中含有DNA-组蛋白连接区域和组蛋白抗体结合位点。在随后的免疫耐受研究中,我们用放射线(~60CO,600rads)照射诱导的凋亡淋巴细胞皮下免疫同系的BALB/c小鼠,成功制作了SLE样症状动物模型,然后用大剂量的H2B_14~28(400μg/小鼠)静脉途径诱导小鼠产生免疫耐受,观察小鼠自身抗体产生和主要临床症状的变化。实验结果显示核小体表位肽H2B_14~28不但可以显著阻断其相关自身抗体(ANA和ds-DNA抗体)的产生,而且对其他自身抗原诱导产生的自身抗体(ACL抗体和RNP抗体)也有明显的抑制作用。在降低实验小鼠自身抗体的同时,利用H2B14~28诱导免疫耐受可以显著改善小鼠SLE样临床症状,包括降低 WP=11 小鼠的白细胞低下、蛋白尿、肾脏免疫复合物沉积和炎症性损伤,特别是对小鼠的肾脏损伤


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