正加速度（+Gz）重复暴露致大鼠脑损伤差异表达基因的筛选

【摘要】： 现代高性能战斗机在机动飞行中可产生很高的正加速度(+Gz)，飞行员中+Gz致意识丧失(G-LOC)的发生率增多，对飞行安全构成严重威胁。因此研究高G值重复暴露对脑的影响，揭示G-LOC的发生机理，已成为航空航天医学研究的重要课题之一。以往的研究主要通过形态学改变及生理生化指标变化等来探讨其病理机制，而从基因水平探讨+Gz所致G-LOC的机理研究很少。目前+Gz引起G-LOC发生的分子机制尚不清楚。因此，从分子病理学角度深入探讨重复+Gz暴露致脑损伤后基因表达的差异，对进一步认识其损伤的分子病理机理具有重要意义。本研究利用大鼠重复+10Gz暴露引发脑损伤的动物模型，观察脑的病理学改变；应用抑制性消减杂交技术筛选+Gz重复暴露大鼠脑的差异表达基因，旨在初步探讨+Gz重复暴露致脑损伤的分子机制。主要研究内容和结果如下： 1、采用SD大鼠重复+10Gz暴露的方法复制了+Gz致脑损伤动物模型。主要病理改变包括大脑皮层部分神经元尼氏体溶解、神经元缺血性改变，白质肿胀；毛细血管部分充血、部分缺血。 2、应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选了+Gz重复暴露大鼠脑的差异表达基因。构建高消减效率的+Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库，扩增后cDNA文库包含约400个白色克隆和100个蓝色克隆，克隆饱满清晰，随机挑取75个白色克隆，制备质粒后，以EcoR Ⅰ酶切分析，表明大部分克隆入质粒载体。 3、经SSH富集的cDNA文库克隆入质粒载体后共获得70个阳性克隆，初步选取50个进行PCR扩增，产物点膜经差异筛选技术发现多个克隆显示杂交信号的差异，筛选阳性克隆。选取其中10个阳性克隆，用序列分析 确定阳性克隆的性质。经GenBank同源性比较，在10个表达差异的基因 中有3个未发现与之明显同源的已知基因，为未知基因，另7个为已知基 因。 4、进一步验证了通过SSH方法得到的差异表达基因片段在+1 OGz重 复暴露脑组织中的差异表达情况。对两个己知基因克隆53#、72#及一个新 基因克隆58#分别设计引物，以GAPDH为内参照，进行半定量Rl、PCR 反应。用凝胶成像分析系统成像并密度扫描分析PCR产物带。为消除系统 及定量误差，差异基因的表达水平以相对表达量即差异表达基因/GA卫DH 的比率来计算。选取的3个差异表达基因用半定量Rl、PCR检定结果表明， 各基因在对照组和暴露组中的表达水平有明显差异(P0.01)。 上述研究结果提示，应用抑制性消减杂交这一筛选差异表达基因的快 速有效工具所发现的3个新的cDNA，可能在+Gz脑损伤的病理过程中起 重要作用。