围手术期TLR4/MD-2的变化及MD-2蛋白的原核表达

【摘要】： 研究背景：TLR4和MD-2是机体识别LPS中必不可少的成分，且对HSP60、EDA和Toxal的识别以及某些抗癌免疫反应的诱导也是TLR4/MD-2依赖的。MD-2既能结合TLR4(TLR2)，促进它们对配基的识别并增强信号转导的强度；也能通过改变TLR4在细胞的分布而影响其功能发挥；还能促进TLR4(TLR2)的蛋白表达。它是天然免疫反应的重要调控分子，能在配基识别、信号转导以及表达分布等水平调控TLR4(TLR2)的功能。因而MD-2和TLR4受体可能与脓毒症/SIRS的发生密切相关。我们在预实验基础上推测，手术创伤无内毒素血症时，TLR4和MD-2的表达模式也会改变，这种改变可能是大手术后SIRS发生的分子机制之一。为阐明TLR4/MD-2对SIRS发病机制的影响及其临床意义，并为后续实验提供理论和材料支持，我们设计了本课题。主要研究目的：动态观察围手术期TLR4/MD-2的表达，分析其临床意义；用生物信息学方法，分析预测MD-2表达变化的内在机制和研究前景；结合现有的实验基础和今后研究计划，首先实现MD-2蛋白的原核表达。 主要技术方法：1. 围手术期TLR4/MD-2的变化：设计自身配对实验，选择12例胸心外科非感染性疾病患者。分别于术前1d，术后第1d 、3d、5d采集外周静脉血单盲法检测各项指标。用密度梯度离心及贴壁法分离纯化单核细胞，经间接免疫荧光染色后FCM检测细胞膜TLR4和MD-2的表达。用放免法测定血浆TNF-α和IL-10；血浆TLR4和MD-2的表达以及TLR4/MD-2复合体含量用ELISA法检测。以鲎试剂法测定血浆LPS。2. MD-2的生物信息分析：用GoldKey软件预测MD2的亲水性、抗原性、柔韧性和可及性。在PHD和SOPMA服务器上进行MD2的二级结构预测和功能位点分析。用吴氏法计算平均抗原指数，确定MD-2的抗原表位。以Comput PI/MW程序计算MD2、GST/MD2、GST/MD2-C的等电点和分子量。用BLAST、PRS和Superfamily服务器分析MD2的结构特点、配基特点和功能特点，搜寻TRL4/TLR2与MD-2结合的可能位点。3. MD-2原核表达与初步纯化：设计与pGEX-4T-1的ORF适配的引物，以pEF-BOS/MD2为模板，用PCR法将MD-2基因克隆到pGEX-4T-1，构建GST/MD-2融合蛋白表达载体pGE/MD2。载体pGE/MD2经BamHI酶切去除5'端165个碱基，构建MD2的C-末端表达载体pGE/MD2-C。在不同时间不同温度，通过不同浓度IPTG诱导GST/MD2和GST/MD2-C在大肠杆菌DH-5α中表达，用SDS-PAGE分析表达量和溶解性。用Western blot法进行融合蛋白的免疫学鉴定；通过 WP=8 包涵体洗涤、尿素变性和梯度透析初步纯化融合蛋白。 主要结果：1. TLR4/MD-2的变化：(1)围手术期血浆LPS和TNF-α在正常范围波动，但IL-10在术后第3d显著增高(p0.001)；(2)单核细胞TLR4和MD-2术后第1d～3d显著上调表达(p0.001)，第5d降至正常，二者同趋势变化；(3)血浆MD-2在术后第3d～5d显著升高(p0.001)，而TLR4仅在第3d轻度升高(p0.05)；(4)血浆存在TLR4/MD-2复合体，并于术后第3d～5d升高(p0.05)，与血浆MD-2同趋势变化。2. 生物信息分析：(1)MD-2是致密的球蛋白，不含蛋白酶位点，二级结构稳定；(2)MD-2在结构上具有两个相对独立的功能域，分别结合配基(C-末端)和相关蛋白质(N-末端)；而与信号转导、脂质代谢以及功能调控相关的ML功能域、磷酸化位点和肉豆蔻酰基化位点集中于C-末端；(3)TLR4和TLR2的相似序列(PPFQLCLHYRDFIPG)可能是MD-2的结合区域；(4)预测了MD-2的抗原表位(RGSDDDYSFCRALK)，模拟出MD2、GST/MD2、GST/MD2-C的等电点和分子量。 3. MD-2的原核表达：(1)成功构建了融合蛋白表达载体pGE/MD2和pGE/MD2-C；(2)用0.2mmol/L IPTG在37℃诱导4h，两种融合蛋白获得最高表达量(占细菌总蛋白30％)；在37℃、32℃、27℃、22℃诱导4h，GST/MD2和GST/MD2-C均以包涵体形式存在，几乎没有可溶性表达；(3)两种融合蛋白均经Western blot鉴定；(4)包涵体经洗涤、尿素变性、透析等处理后，融合蛋白得到初步纯化，可以用作抗原，免疫动物以制备抗体。 主要结论：(1)血浆LPS和TNF-α正常，但IL-10有显著升高，说明手术创伤后内毒素血症并不常见，提示术后有免疫抑制反应。(2)单核细胞TLR4和MD-2术后显著上调表达，使机体对致炎因子的敏感性增强，这可能是SIRS/脓毒症发生的分子机制之一，是抗菌治疗效果差的重要原因。(3)手术创伤后MD-2在血浆中较高浓度稳定存在并与TLR4结合成复合体，提示MD-2对损伤反应敏感，可能发挥广泛的远距离作用。其机制在于MD-2是致密的球蛋白，具有稳定的二级结构且不含蛋白酶位点。(4)手术创伤后单核细胞TLR4和MD-2同步上调表达，血浆存在TLR4/MD-2复合体，提示MD-2可能在血浆和细胞膜均具有生物学功能。其结构基础在于MD-2具有两个相对独立的功能域，分别结合配基和相关蛋白质。而与信号转导、脂质代谢以及功能调控相关的功能位点集中于C-末端，提示C-末端是信号转导和配基识别的关键部位。(5)手术创伤后血浆MD-2和TLR4/MD-2的浓度增高，并可能在LPS的识别与信号转导过程中发挥调控作用。(6)MD-2可能结合于TLR4和TLR2的相似序列，并籍此影响它们功能；而MD-2的96-110位氨基酸序列可能是B细胞抗原表位。(7)原核表达载体的成功构建以及融合蛋白的诱导表达和免疫学鉴定为后续实验研究打下了基