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缝隙连接介导的细胞间通讯及其与逼尿肌不稳定关系的实验研究

周逢海  
【摘要】:背景及目的:逼尿肌不稳定(detrusor instability,简称DI)指储尿期出现逼尿肌无抑制性收缩,是多种病变(如神经疾病、膀胱出口梗阻等)的一个病理生理环节,是最常见的一种膀胱功能障碍。迄今为止,对DI的确切发病原因仍不清楚,且临床治疗效果不尽人意。因此,临床上迫切需要寻找一种行之有效的治疗DI新方法。 由于正常逼尿肌收缩主要是由神经参与的一种协调性活动,因此逼尿肌细胞间的兴奋传递作用并不起主导作用。而在DI发生过程中,由于逼尿肌本身是一种具有自发性兴奋能力的组织,对于单个的逼尿肌细胞而言,当其兴奋后通过兴奋收缩耦联要引起整个膀胱组织协调一致收缩,必须经过特殊的细胞间传递机制才能完成。因此,细胞间的兴奋传递可能在DI发生中有极其重要的作用。 细胞间兴奋传递在心肌、子宫等组织的正常和异常功能活动中的作用已为人们所熟悉:存在于心肌细胞之间的闰盘结构使起搏点的兴奋冲动能迅速扩布于整个心脏;在子宫平滑肌中缝隙连接(gap junctions, GJ)的形成是足月分娩和早产发动的结构基础,而抑制GJ的增加可成功地治疗和预防早产等。 目前,对膀胱逼尿肌的兴奋传导所知甚少,国内外尚未见细胞间兴奋传递与DI关系的深入研究报道。因此,研究逼尿肌细胞间兴奋传递,将有助于我们了解DI的发生机理,并为开发新型DI治疗药物提供理论依据。 本课题通过改良的不全结扎大鼠膀胱颈部和/或近端尿道的方法,建立了更加稳定、合理的大鼠膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)引起的DI动物实验模型,并从以下几个层次逐步深入地对膀胱逼尿肌组织及细胞进行研究。第一,在了解BOO后逼尿肌功能变化的基础上,进一步观察逼尿肌细胞间的超微结构变化,以揭示其功能变化的组织形态学基础。第二,在组织水平上从转录及翻译水平研究缝隙连接基因(connexin,Cx)及其蛋白表达与DI的关系及其生物学意义,探讨细胞间缝隙连接基因蛋白与DI发生的关系。第三,首次利用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)结合荧光光漂白恢复技术(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP),来动态研究观测逼尿肌缝隙连接介导的细胞间通讯(gap WP=13 junction intercellular communication,GJIC)的功能变化,对DI的发病机理做进一步探讨,为临床治疗提供理论性指导。第四,利用LSCM及FRAP技术观察缝隙连接阻滞剂18β-GA对培养的大鼠DI逼尿肌细胞GJIC功能的影响,为临床上采用阻断细胞间兴奋传递来治疗DI开辟新的方法及提供理论依据。 方法:本实验通过改良的不全结扎大鼠膀胱颈部和/或近端尿道的方法,建立了更加稳定、合理的大鼠BOO后引起DI的动物实验模型。根据尿动力学检查结果采用随机法将动物分为:逼尿肌稳定组即正常对照组(control group),逼尿肌不稳定组(Detrusor Instability Group)。光镜和透射电镜下观察逼尿肌组织及其细胞间连接的超微结构改变;应用RT-PCR技术及Western-blot方法,从转录及翻译水平检测细胞间缝隙连接蛋白基因(Cx)及其蛋白在DI中的表达变化;免疫组织化学方法鉴定培养逼尿肌细胞;采用间接免疫荧光染色法,对培养逼尿肌细胞Cx43表达进行定位分析;利用LSCM及FRAP技术,来研究观测逼尿肌GJIC的功能变化;观察缝隙连接阻滞剂18β-GA对培养的大鼠DI逼尿肌细胞GJIC功能的影响变化。 结果:主要研究结果如下: 1.采用改良法建立的动物模型较之以往采用的方法能够更为确切地模拟临床上最为常见的BOO类型的疾病。其DI的发生率高达80.6%。 2.光镜观察:对照组逼尿肌细胞之间平行排列,细胞呈梭形或椭圆形,分布均匀。DI组细胞增大,形状多样,排列紊乱。电镜观察:对照组逼尿肌细胞间连接以中间连接为主,细胞内膜面有附着于胞质内的微丝。DI组逼尿肌细胞间连接以缝隙连接为主,肌膜周围有高电子密度物质堆积。 3.Cx43、Cx40、Cx45mRNA在DI组及正常对照组膀胱逼尿肌中均有表达。DI组中Cx43、Cx40mRNA表达较正常对照组明显增加,分别增加5.4和2.9倍,各组两者相比较具有显著性差异;而Cx45mRNA表达无显著性差异。 4.DI组逼尿肌组织有高水平的Cx43蛋白表达,与对照组相比较增加3.2倍,两者相比较具有显著性差异,与其Cx43mRNA表达程度相近似。 5.间接免疫荧光染色方法发现,DI组逼尿肌细胞Cx43的表达,呈现较强的FITC绿色荧光,大量强阳性反应产物主要分布于细胞膜上。正常对照组Cx43的表达,FITC荧光产物强度明显减弱。 6.FRAP方法研究膀胱逼尿肌细胞GJIC功能变化,结果显示:荧光标记染色膀胱逼尿肌细胞呈单层贴壁生长。在DI组中,经瞬间漂白后细胞内荧光强度明显变弱,随着时间的推移,荧光逐渐恢复,至第4min时,可见荧光强度明显恢复,平均荧光 WP=14 恢复率为(35.791±0.836)%,而单个细胞未见荧光强度恢复现象。正常对照组在相同的时间内,漂白细胞荧光恢复不明显,平均荧光恢复率为(8.645±0.673)%。在漂白后的第4min时,两组平均荧光恢复率相比较,DI组显著高于对照组,两者具有显著性差异。表明DI逼尿肌细胞间兴奋传递增强。 7.不同浓度的18β-GA(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L)作用于DI组培养逼尿肌细胞2小时后,明显降低逼尿肌细胞的荧光恢复率,其荧光恢复率分别为20.25


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