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人抗菌肽hBD2在肺腺癌细胞A549中的表达、纯化及其抗菌活性检测

杜剑平  
【摘要】:背景:随着抗生素的大量使用,耐药菌株也呈增多的趋势,寻找新一代抗茵药物已迫在眉睫。抗菌肽是广泛存在于自然界中真核细胞体内的一类抗菌物质,在宿主体内起着重要的抗炎作用。人β-抗菌肽(human Beta-Defensin,HBD)是抗菌肽家族众多成员之一,在人体的免疫系统中起着重要作用。其作用机理是:①作为一种阳离子小分子多肽,其二聚体可与目标菌的质膜结合,在膜上形成电压敏感的离子通道,引起胞内物质的外漏而杀死细菌;②抗菌肽也可通过趋化反应,快速增强单核细胞炎症反应及免疫反应;③β-抗菌肽还通过与CCR6相互作用,调动未成熟的树突状细胞和记忆T细胞。在先天性免疫与获得性免疫反应之间起桥梁作用。抗菌肽是一种理想的新一代抗生素。 大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞/杆状病毒群蛋白表达系统和哺乳动物细胞表达体系是基因工程的四种体系。借助基因工程生产hBD2这种具有细胞毒性的蛋白,应用上述的表达体系存在诸多困难,因此,尝试一种新的真核表达体系合成hBD2就有十分重要的理论和实际意义。有文献显示,肿瘤细胞可以表达某些外源基因,能否借助其表达hBD2尚无文献报道。本研究目的是试图通过在人肺癌细胞中构建人癌胚抗原CEA(Human carcinoembryoni antigen)与hBD2融合基因表达系统,尝试生物工程合成HBD-2的可能。 方法:(1)采用PCR和基因重组技术构建pBuescriptSK-CEA(信号肽)-EK(位点)-hBD2(成熟肽)[注:下文以CEAs代替CEA(信号肽),hBD2m代替hBD2(成熟肽),EK代替EK(位点)]重组载体,直至构建成功逆转录表达载体pLNCX2-CEAs-EK-hBD2m。(2)采用磷酸钙转染法将逆转录表达载体pLNCX2-CEAs-EK-hBD2m导入逆转录包装细胞PT67中,G418筛选出抗性克隆细胞株,经NIH 3T3检测病毒滴度后,收集病毒原液感染A549细胞,经G418筛选出抗性克隆细胞株,RT-PCR检测转染基因细胞的mRNA水平的表达,选择表达量高的细胞株,扩增培养。(3)应用ELISA、Western blot检测整合外源基因细胞的目的蛋白表达,收集明确表达外源蛋白的细胞培养上清,肠激酶切割后,采用硫酸铵沉淀法、凝胶层析过滤、离子 第三军医大学博士学位论文 层析过滤、超滤离心管反转离心的方法分离和纯化目的蛋白。(4)采用细菌平板生长抑 制法和抗菌谱实验检测hBDZ的抗菌活性。 结果:(l)构建成功的逆转录表达载体pLNCxZ一CEAs一EK一hBDZm经琼脂糖电泳和 测序检测,结果与其背景资料相符合。在此重组基因中,CEA信号肤起着诱导宿主细 胞高表达分泌性hBDZ的作用,EK将hBDZ从融合基因中分离出来的目的,去自身信 号肤的hBDZ片段是所需要的目的基因片段。(2)采用磷酸钙转染法将逆转录表达载体 pLNCXZ一cEA信号肤一EK一BDZ成熟肤导入逆转录包装细胞PT67后,G418筛选出单 克隆细胞株,细胞活性检测与未转染的细胞无显著差别,采用NIH 3T3细胞检测,PT67 产生的病毒颗粒可达3xl护cfi汀而,收集病毒颗粒后,转染宿主细胞A549,G418筛 选出单克隆细胞株,挑选生长良好的细胞株8株,扩增培养,PT一CR检测细胞在mRNA 水平的转录强度,与各自内参B一actin比较后,选择mRNA表达强的2株细胞,扩增 培养。(3)E LlsA和western bot检查均证明在宿主细胞中出现目的蛋白的表达,大量 收集宿主细胞的培养基上清后,采用硫酸按沉淀法、凝胶层析过滤、离子层析过滤、 超滤离心管反转离心的方法分离和纯化目的蛋白,最终得到的目的蛋白浓度为58Op 岁而,在以大肠杆菌为指示菌的平板细菌抑制实验中,目的蛋白的抑菌强度可达++++, 抗菌谱实验:hBDZ对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠球菌的最低 抑菌浓度分别是36.3 mg/L、36.3mg几、72.5m叭、72.5m叭。证明整合有融合基因的 宿主细胞分泌具有抗菌活性的hBDZ。 结论:(l)eE^似uman earcinoembryonie antigen)是肠道肿瘤细胞分泌的一种癌性 蛋白,在某些其他肿瘤细胞如肺腺癌中也可大量分泌。因此可以推论:在这些CEA 高分泌的肿瘤细胞中必然存在高效转录和翻译CEA基因的分子生物学机制,本研究是 试图利用这一特性,构建CEAs与hBDZm融合基因,并利用逆转录病毒载体将融合 基因整合到能大量分泌CEA的肿瘤细胞中,达到在宿主细胞中高表达分泌型蛋白 hBDZ的目的。在实验中,CEAs引导宿主细胞表达原本表达的hBDZ。(2)基因工程常 用的是:大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞/杆状病毒群蛋白表达系统和哺乳动物细胞四种 表达体系,当需要表达的外源基因蛋白如hBDZ,由于其对宿主细胞具有一定的杀伤 性,不能在大肠杆菌、酵母菌中大量表达或只能非生物活性的蛋白表达;在昆虫细胞/ 杆状病毒群蛋白表达系统和哺乳动物细胞表达时,由于宿主细胞不具备永生性的特点, 不能用于在大规模的基因工程生产时。因此必须考虑尝试运用肿瘤细胞作为真核表达 体系,在本实验中,融合基因整合入宿主A549细胞基因组后,在保持环境中高浓度 的G418选择压力下,历时2月后,宿主细胞表达外源蛋白hBDZ未见有减低的趋势。 第三军医大学博士学位论文 (3)肿瘤细胞的基因变化较大,利用肿瘤细胞进行基因工程大规模生产有用的蛋白,文 献报道不多,其中许多机理可能还需要进一步的研究。就本实


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