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人新基因EOLA1生物学特性及相互作用蛋白研究

刘月明  
【摘要】:严重烧伤患者由于外源性细菌入侵或肠源性细菌和内毒素移位,易于诱发脓毒症(Sepsis),引起失控性炎症反应,临床上预防和治疗措施都十分棘手,死亡率极高。目前已证实内毒素(Lipopolysaccharide, LPS)是脓毒症的主要启动子,LPS与可溶性CD14分子结合活化血管内皮细胞,内皮细胞的活化在脓毒症的发生、发展中具有重要作用,阐明内皮细胞活化和功能改变机制对于重度烧创伤患者的救治具有十分重要的理论和实践意义。 我室长期致力于烧伤早期血管内皮细胞损伤机制方面的研究,内皮高表达脂多糖相关因子1 (endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1, EOLA1)系我室于2002年应用抑制消减杂交技术发现,并以人类新mRNA登陆到Genbank nr库(No.AY074889)。阐明人类新基因的功能是一项非常困难,但意义重大的工作。随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成,基因工程领域已经进入功能基因组时代。功能基因组研究的任务是对基因组中全部基因的功能加以认识。蛋白质相互作用研究是认识基因功能的一个重要途径。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分,DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 本研究从我们前期已经获得的EOLA1全长cDNA序列着手,进行了EOLA1生物信息学分析、EOLA1在人体组织和癌细胞系中的表达、EOLA1在ECV304细胞中的亚细胞定位及EOLA1相互作用蛋白的筛选和验证研究,以期对EOLA1的生物学功能有初步的了解。 本研究的主要结果和结论如下: 一、EOLA1基本生物学特性研究 1. EOLA1的生物信息学分析 基于EOLA1全长cDNA序列,从序列比对、染色体定位、基因结构分析、编码蛋白理化性质分析、蛋白质位点和序列模式预测等几个方面对EOLA1进行分析:EOLA1 WP=14 编码的蛋白EOLA1经网上同源性比对没有发现与之高度同源的人类已知蛋白;EOLA1与鼠111002L19蛋白高度同源,到目前为止,对鼠111002L19蛋白功能也不清楚;对其二级结构进行预测发现在EOLA1蛋白分子中存在酪氨酸激酶II和蛋白激酶C磷酸化位点以及一个螺旋-转角-螺旋(HTH)基序,这些结构特征赋予EOLA1信号转导能力,可以作为信号分子发挥作用。 2. EOLA1在人体组织和癌细胞系中的表达 随机引物法标记EOLA1的cDNA片断为探针,应用Northern blotting技术观察EOLA1在LPS刺激后的表达变化及其在人体组织和癌细胞系中的表达谱。结果显示:①在杂交膜1400bp处有一条清晰的杂交显影,和该基因的全长cDNA (1404bp)一致;② EOLA1在LPS刺激的ECV304细胞中表达强度明显高于未经LPS刺激的ECV304细胞,该结果提示EOLA1的表达受LPS诱导,可能在LPS激活内皮细胞的过程中发挥作用;③ EOLA1在12个人体组织中的表达谱为:心脏、骨胳肌、肾脏、肝脏和胎盘有较强的表达,结肠、小肠、脾脏有较弱的表达,脑、胸腺、肺和外周白细胞则未见表达,表明EOLA1的表达有一定的组织分布选择性,倾向于在血流比较丰富的组织中表达;④EOLA1在7癌细胞系表达谱为:早幼粒白血病系HL-60、海拉细胞系S3、慢性骨髓性白血病系K-562和肺癌细胞系A549都有表达,以成淋巴细胞瘤性白血病MOLT-4和结直肠腺癌SW480表达水平最高,黑素瘤G-361无表达。 3. EOLA1的亚细胞定位 应用增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)作为报告分子,研究EOLA1在ECV304细胞中的亚细胞定位情况。把EOLA1的ORF片断定向亚克隆入真核表达载体pEGFP-N2中,转染重组载体到ECV304细胞,通过Western blotting检测EGFP-EOLA1融合蛋白的表达,证实重组载体可以表达EGFP-EOLA1融合蛋白。应用基因融合表达的特性,在激光共聚焦显微镜下观察EOLA1在ECV304细胞中的亚细胞定位,发现EOLA1在ECV304细胞中呈全细胞分布,有细胞核聚集现象。 二、EOLA1相互作用蛋白的筛选与验证 1. EOLA1相互作用蛋白筛选 在这一部分研究中,我们构建了重组诱饵表达质粒pGBKT7-EOLA1,并经过了酶切和测序鉴定,然后对重组诱饵表达载体进行毒性效应检验和自激活效应检测,证实重组载体对宿主菌无毒性作用、没有自激活报告基因效应,可以用于文库筛选;应用成功构建的重组诱饵融合表达载体筛选正常人肝cDNA文库中与EOLA1相互作用蛋白,共获得12个阳性菌株,经过回复性杂交实验验证有8个阳性菌株为真阳性菌株;分离文 WP=15 库质粒并测序,得到文库质粒插入片断序列,在GenBank中进行同源性比对分析发现这8个文库随机插入片断序列均为编码金属硫蛋白2A(Metallothionein 2A, MT2A)的cDNA序列。 2. EOLA1与MT2A相互作用关系的验证 哺乳细胞双杂交和免疫共沉淀实验证实MT2A与EOLA1在哺乳细胞中存在相互作用;此外免疫荧光共定位成像技术发现MT2A与EOLA1在ECV304细胞中存在共定位现象,主要共定位于胞核与核膜周围。 MT2A是体内重要的应激保护蛋白,受LPS诱导,并与细胞的增殖、分化密切相关。与MT2A的相互作用关系,及其在人体组织中的表达和亚细胞定位情况提示EOLA1可能是血管内皮细胞受LPS激活后上调表达的与细胞活化相关的转录因子。


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