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MSCs修复血管内膜及对平滑肌部分生物学行为的影响

武晓静  
【摘要】:研究背景: 平滑肌细胞增生迁移是血管损伤后再狭窄、动脉粥样硬化、高血压等多种增殖性血管疾病的共同病理生理基础,关于增殖性血管疾病治疗的研究热点也主要集中于平滑肌增生机制的探讨及如何有效抑制平滑肌细胞过度增生。虽然医学研究的迅速进展使人们对细胞因子、信号转导途径和相关基因在动脉粥样硬化和再狭窄发病机制中的认识越来越深,但对最终调节平滑肌增生的靶分子、关键基因和共同通路仍缺乏本质认识。直接抑制、破坏细胞分裂、增生的措施虽然能显著抑制平滑肌过度增生,如药物洗脱支架和血管内放射治疗都是临床防治再狭窄的有效手段,但其往往还会干扰内皮修复,远期效果并不十分肯定。血管内皮细胞能合成和分泌多种血管活性物质,在维持血管正常结构和血液功能方面发挥重要作用。多项研究表明,生理状态下血管内皮分泌的促增殖、缩血管物质和抑制增殖、舒血管物质维持动态平衡,而血管损伤后则分泌的促增殖和缩血管物质明显占优势。这些研究提示,虽然平滑肌增生是构成血管增殖的直接病因,但内皮损伤在增殖性血管疾病发病中可能起着始动和促进的作用。因此,这些研究也提示,对增殖性血管疾病的防治不能只重视如何有效抑制、破坏平滑肌细胞增生,更要重视如何促进内皮再生、改善内皮功能。利用细胞移植替代、修复受损组织或器官的结构与功能是疾病治疗的新方法,虽然自体静脉内皮细胞移植能促进损伤动脉再内皮化和减轻新生内膜增生,但静脉内皮与动脉内皮相比存在异质性,且取材需外科手术。骨髓基质干细胞(Marrow stromal stem cells,MSCs) 是骨髓中存留的一种成体干细胞,在体外促内皮生长分化的细胞因子诱导下能分化为内皮细胞,且相对易于分离和扩增,理论上是进行细胞移植较为理想的种子细胞。目前已经发现骨髓基质干细胞移植能促进缺血组织血管新生和梗死心肌再生,但尚不清楚骨髓基质干细胞移植能否促进内膜修复、抑制平滑肌细胞增生,防治损伤性血管疾病。 研究目的: 1. 观察不同内皮细胞生长状态与平滑肌增殖迁移能力的关系,探讨内皮再生在增殖性血管疾病发病中的作用;2. 观察骨髓基质干细胞体外修复血管内膜时向内皮分化 本课题受国家自然科学基金资助(NO.30270568) WP=14 的能力及对平滑肌细胞增生迁移的影响,探讨骨髓基质干细胞种植修复损伤血管的可能性;3. 观察紫杉醇对兔血管平滑肌和内皮细胞增生影响的剂量效应和时间效应,探讨体外内膜修复过程中紫杉醇引起平滑肌细胞延迟增生的机制;4. 通过建立细胞共培养体系,观察紫杉醇联合骨髓基质干细胞种植能否既更好的抑制平滑肌细胞增生,又促进完整内膜修复,为骨髓基质干细胞种植重建药物洗脱支架植入血管段生物学功能提供实验依据。 方法与技术路线: 1. 不同内皮细胞生长状态与平滑肌增殖迁移能力的关系:分别用酶消化法和组织块法分离培养兔血管内皮和平滑肌细胞,将内皮细胞接种于下室,平滑肌细胞接种于上室,建立细胞共培养体系,用3H-TdR掺入法检测平滑肌细胞DNA合成、western blot检测平滑肌增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达、RT-PCR检测平滑肌α-SM-actin mRNA 表达、流式细胞法检测平滑肌细胞周期、模拟Boyden小室检测平滑肌细胞迁移计数。 2. 骨髓基质干细胞种植体外修复血管内膜时向内皮分化及对平滑肌细胞增生迁移的影响:分离培养人骨髓基质干细胞,用流式细胞仪分析骨髓基质干细胞CD34、CD105、CD166表达,免疫荧光细胞化学法分别观察细胞因子诱导的和与内皮共培养的骨髓基质干细胞vWF/和Flk-1蛋白表达;将内皮细胞和/或骨髓基质干细胞接种于下室,平滑肌细胞接种于上室,建立细胞共培养体系,模拟血管内膜修复过程,用3H-TdR掺入、PCNA蛋白检测和平滑肌细胞迁移计数等方法观察骨髓基质干细胞种植对平滑肌增生迁移的影响。 3. 紫杉醇对体外内膜修复过程中兔血管平滑肌和内皮细胞增生迁移及紫杉醇联合骨髓基质干细胞种植对平滑肌增生的影响:培养兔血管平滑肌和内皮细胞,将平滑肌接种于上室、内皮细胞接种于下室,建立细胞共培养体系:①观察不同浓度紫杉醇对兔血管平滑肌和内皮细胞DNA合成、PCNA蛋白表达的影响,测定不同浓度紫杉醇作用下兔血管平滑肌和内皮细胞的迁移率,用直线回归法推算紫杉醇对平滑肌和内皮细胞增生迁移的半数有效抑制浓度IC50。②于下室加入10nmol/L紫杉醇干预20分钟,模拟紫杉醇对血管壁平滑肌和内皮细胞的作用方式。分别于干预前、干预后1天、3天、7天、10天观察紫杉醇对兔血管平滑肌和内皮细胞DNA合成、细胞计数的影响。③于下室加入紫杉醇使其终浓度为10nmol/L,作用20分钟后,弃去未进入细胞的游离紫杉醇,然后随机分为4组:对照组、融合生长内皮组、对数生长内皮组和骨髓基质干细胞种植组,第10天时检测平滑肌细胞3H-TdR 掺入率和PCNA蛋白表达。④将兔内皮细胞用10nmol/L紫杉醇作用20分钟后,弃去紫杉醇,再将骨髓基质干细胞种植 WP=15 于成熟内皮层中,分别于共培养的第5,10天用免疫荧光细胞化学法观察与内皮共培养的骨髓基质干细胞vWF和Flk-1蛋白表达。 结果: 1. 不同内皮细胞生长状态与平滑肌增殖迁移能力的关系: 融合生长内皮使平滑肌细胞3H-TdR掺入量和PCNA蛋白表达明显降低,增加平滑肌细胞停留在G0/G1期的比例,上


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