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创伤大鼠单核细胞、肺泡巨噬细胞基因表达的差异性研究

谢志坚  
【摘要】:多器官功能不全综合征(MODS)是脓毒症、脓毒性休克或全身(系统)性炎症反应综合征(SIRS)时的器官功能改变,发病急,进展快,死亡率高,全身炎症瀑布式反应失控性激活及氧摄入和氧传递比例失衡是MODS显著的病理生理紊乱。肺是全身静脉血的滤器,又是重要的代谢器官。MODS病人常最先出现肺功能不全,严重表现为急性呼吸窘迫综合症(ARDS)。巨噬细胞是介导细胞免疫及体液免疫的重要细胞,与严重脓毒症为特征的过度炎症反应紧密相联。外周血单核细胞既可移至血管外组织后成为常驻的器官特异性巨噬细胞,又可作为免疫效应细胞募集到炎症、损伤、异物或肿瘤排斥部位。肺泡巨噬细胞是肺部第一线的防御机制,主要维持肺的免疫稳态,既有专职的吞噬作用,又产生细胞因子、生长因子、活性氧簇及花生四烯酸衍生物等大量介质,拥有其它部位巨噬细胞所不具有的独特表型。 研究表明,单核细胞及肺泡巨噬细胞是具有明显异质性的细胞,分化发育上既相互联系,功能效应上又明显不同。单核细胞及肺泡巨噬细胞的异质性在创伤后的免疫功能障碍中具有重要作用,然而对创伤后单核细胞及肺泡巨噬细胞mRNA水平上的表达变化了解得并不多。单核细胞及肺泡巨噬细胞本身内部及相互之间的差异提示,研究单核细胞及肺泡巨噬细胞之间mRNA表达水平的变化差异,无疑对深入了解单核/巨噬细胞在免疫学中的作用及调控单核/巨噬细胞具有非常重要的意义。 有鉴于此,本课题采用清洁级大鼠,通过双后肢股骨部位砸伤复合LPS刺激模型,采用SMART和SSH方法,构建创伤大鼠单核细胞与肺泡巨噬细胞的差异表达基因显示文库,并对验证为阳性的EST片段进行测序、克隆及同源性分析,对找到同源性较高的基因,从基因差异表达角度探讨了单核细胞及肺泡巨噬细胞在创伤复合LPS刺激后的功能改变。对在GenBank无较高同源性的EST片段进行提交注册。 主要研究成果和结论如下: 1、用SMART和SSH相结合的方法构建了创伤复合LPS刺激后大鼠单核细胞及肺泡巨噬细胞cDNA差异显示文库,单核细胞获得89个克隆,肺泡巨噬细胞获得152个克隆。 第三军医大学博士学位论文 2、采用特异性PCR扩增、差异筛选试剂盒及反向northern等方法对正向和反向 差异表达基因cDNA文库阳性菌落进行筛选和鉴定,找出具有真正意义的阳性克隆和 有差异表达的片段58个,其中单核细胞巧个,肺泡巨噬细胞43个。 3、通过对单核细胞及肺泡巨噬细胞在创伤复合LPS刺激后差异表达片段测序和 进行同源性分析。结果显示,创伤后单核细胞及肺泡巨噬细胞差异表达的mRNA涉及 能量代谢、趋化作用、细胞增殖与分化、信号转导等复杂的过程,创伤后单核细胞与 肺泡巨噬细胞的功能差异可能与此有关。 4、在GenBank提交并成功注册了两个新的EST序列,登录号分别为AY577286 及AY577287。


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