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人幽门螺杆菌蒙古沙鼠适应性定植相关蛋白的鉴定及功能研究

郭刚  
【摘要】:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是人类慢性活动性胃炎和消化溃疡的重要原因,与胃癌和胃淋巴样组织淋巴瘤的发生也极度相关。目前人类对其生物学特点、致病机制及其与宿主的关系等方面均尚未完全阐明。随着对Hp在分子水平上的研究不断深入,人们发现Hp较其它细菌表现出更高的生物多样性,提示该菌面对复杂的定居环境,具有高度的变异性和独特的适应性机制。研究Hp在定植前后的适应性变化可能会为整体上阐明Hp的适应性定植机制打下基础,也有助于阐明Hp的致病机制及其与宿主之间的相互关系。Hp菌26695株和J99株全基因组测序工作的完成,为后续的蛋白质组学研究提供了条件。近几年,国内外研究者采用蛋白质组学技术相继在Hp的遗传变异、生理、免疫靶点筛选及毒力因子确定等方面进行了一系列的研究,而在Hp适应性定植方面却未见相关研究报道。 本研究用Hp口服感染蒙古沙鼠,建立动物模型,通过动物体内的连续传代,驯化出稳定的感染适应株,然后采用双向电泳对适应性定植前后的菌株进行蛋白质表达谱的比较分析,再通过MALDI-TOF质谱技术鉴定差异候选蛋白,最后通过同源重组技术构建其中功能未知基因HP0318的突变株,探讨该基因在适应性定植中的作用。具体研究结果如下: 1.Hp蒙古沙鼠感染模型的建立及感染适应株的鉴定。将Hp临床分离株口服感染蒙古沙鼠,然后将分离菌株连续在沙鼠体内进行传代感染,其感染率逐步提高,当传到第10代后,感染率稳定在90%以上;用第13代分离株M13进行了长期感染沙鼠的观察,结果感染后24周以内Hp感染率与定植密度均未见下降; Hp在感染期间引起了与人体相似的炎症、溃疡等病理学改变。结果说明本研究用M13株已建立起稳定的Hp感染沙鼠模型。通过光镜和电镜对适应性定植前后的菌株M0和M13进行初步比较, 发现M13菌体变长、变粗,螺旋更密集。此外,通过SDS-PAGE对两个菌株的全菌蛋白进行初步分析,在20KDa附近可见到M13菌株有一较高表达的蛋白条带。结果提示M13菌株发生了某种与定植相关的适应性变化。 2.幽门螺杆菌适应性定植沙鼠后的蛋白质组的改变。采用双向电泳对适应株M13 WP=12 及其原代株M0的全菌蛋白进行分离,经PDQuest6.0软件分析,两个菌株的蛋白图谱相关系数达到0.78,CBB染色可分别检出564±32和602±27个蛋白点。选择差异最明显、点光密度值较大的5个蛋白点,用MALDI-TOF-MS进行肽质量指纹图谱分析和数据库查询,结果成功鉴定出4个差异蛋白,其中HP0318编码蛋白、异柠檬酸脱氢酶(Icd)及ADP-L-D-甘露庚糖表异构酶(RfaD)表达量在M13中有显著升高,氢化酶表达/形成蛋白(HypB)仅在M13中被CBB染色检测到。根据文献报道,RfaD与HypB可分别通过调控脂多糖和氢化酶的合成与结构影响Hp的定植,Icd作为能量代谢的关键酶在Hp的适应性变异中也可能发挥着重要的作用,因此,本研究筛检到的适应性定植相关蛋白具有较高的可靠性,也提示鉴定到的另一个功能未知蛋白HP0318与Hp的适应性定植相关。 3.幽门螺杆菌适应性定植前后HP0318基因的序列比较。为了了解HP0318基因在Hp适应性定植过程中是否发生了变异,本节实验扩增了M0和M13菌株基因组中的HP0318全长基因,再克隆到pMD18-T载体进行测序,将测序得到的HP0318基因提交GenBank进行BLASTn分析,结果显示与之匹配的序列只有2条,分别为Hp26695菌株 HP0318基因和J99菌株的jHp0301基因,未见其它种属的基因与之匹配,提示HP0318基因属于Hp特异性基因;采用DNAsis软件对M0及M13测序结果以及Hp26695和J99株相应基因的序列进行多重序列比对,显示M0及M13菌株的HP0318基因高度保守,相似性达到99.5%,与26695株的相似性为91.1%,与J99株的相似性只有81.3%。结果说明①HP0318基因在不同来源的Hp菌株中存在较大的基因多样性;②Hp在沙鼠体内适应性定植可能并不是由基因HP0318的遗传学变异引起。 4.HP0318基因在幽门螺杆菌适应性定植沙鼠过程中的作用。通过PCR扩增HP0318基因上下游片段,在中间插入氯霉素抗性基因(catGC)作为筛选标记,并克隆到质粒pBluescript SK中构建成缺失突变的打靶载体,将其转化沙鼠适应株M13,经过同源重组,对出发菌的HP0318基因进行置换突变,然后用经氯霉素抗性筛选和PCR鉴定的突变菌株感染蒙古沙鼠,观察其定植能力和致病性与未突变的M13的差异。结果HP0318基因突变株与非突变株的感染率相差不显著,分别是9/10和10/10,病理学检查发现两个菌株均在沙鼠胃内激发了充血和炎症反应,差异不明显。但是,两个菌株在胃内的定植密度有着显著的差异,突变株定植密度有约5倍的减少。结果说明,虽然HP0318基因的失活并没有使Hp在沙鼠胃内的感染力和致病力完全消失,但对其定植能力还是产生了较大的影响,基本可以确定HP0318基因在Hp的沙鼠适应性定植过程中发挥了重要的作用。 WP=13 总之,本研究通过比较蛋白组学技术,从整体上对Hp适应性定植蒙古沙鼠后的蛋白质变化进行了研究,筛选、鉴定出4个适应性定植相关蛋白,并且首次发现和证明功能未知基因HP0318与Hp在沙鼠中的适应性定植存在相关性。


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