收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

脂多糖结合蛋白功能位点分析及其抑制性多肽的筛选

徐德斌  
【摘要】:脂多糖结合蛋白(LBP)是存在于正常人和动物血清中的一种糖蛋白,属于I型急性期反应蛋白,与脂多糖(LPS)的类脂A部分具有高度亲和性。LBP具有致炎和抗炎的双重作用。LBP既可将LPS多聚体转换为单聚体,加速LPS与其受体CD14结合,显著放大LPS的致炎作用;也可加速LPS与靶细胞膜上的清除受体结合,使LPS被靶细胞清除;还可催化LPS与脂蛋白结合,后者可中和LPS的生物学活性,加速体内LPS的清除。LBP的不同作用可能是由不同功能位点决定的。当LBP的某一功能位点与LPS的类脂A结合时,表现为对LPS的增敏作用;而当另一功能位点与LPS的类脂A结合时,则可增强LPS的内化,表现为对LPS的抑制性调理作用。本实验应用噬菌体呈现技术研究LBP的致炎功能位点和抗炎功能位点,并获得具有抑制LBP致炎活性的可溶性多肽。 方法: 1. 采用经典的亲和富集法对噬菌体随机12肽库进行4轮亲和筛选, 以LPS为靶分子,前2轮采用酸洗脱,第3、4轮采用LBP竞争性洗脱,获得可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体克隆。应用结合实验和竞争抑制实验进一步确证。 2. 应用细胞因子生成抑制实验,即通过ELISA法测定人外周血单个核细胞培养上清中TNFα含量,对筛选出的噬菌体克隆进行功能性筛选,获得具有阻断LBP致炎作用的噬菌体克隆。通过流式细胞术观察LPS的内化,获得具有阻断LBP抗炎作用的噬菌体克隆。 3. 将获得的噬菌体克隆进行DNA测序,根据噬菌体克隆基因中所插入的外源DNA序列推导出呈现的外源多肽氨基酸序列。应用Blast软件将多肽序列与LBP分子的一级结构序列比较分析,对LBP的致炎和抗炎功能位点进行定位。 4. 根据获得的具有阻断LBP致炎作用的噬菌体克隆呈现的外源多肽序列,采用FMOC固相合成法化学合成具有阻断LBP致炎活性的游离型多肽。 5. 用细胞因子生成抑制实验检测合成多肽的抗炎活性。 结果: 1. 采用亲和筛选方法,以LPS为靶分子,经过2轮筛选,从噬菌体随机12肽库 WP=11 中获得了可与LPS结合的噬菌体克隆。再经过2轮LBP竞争性筛选,获得了可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体克隆。 2. 从获得的可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体肽库中随机挑取100个噬菌体克隆,进行结合实验和竞争抑制实验。结合实验发现100个克隆中有72个克隆与LPS有较高的结合活性,进一步的竞争抑制实验表明其中16个噬菌体克隆具有与LBP竞争结合LPS的活性,进一步进行功能筛选。 3. 细胞因子生成抑制实验发现,9个噬菌体克隆可显著抑制LBP增敏LPS诱导PBMC分泌TNFα 的作用; LPS内化抑制实验表明,这9个噬菌体克隆均无抑制LBP增强LPS内化作用的活性,其展示肽具有抑制LBP致炎作用的活性。根据上述9个噬菌体克隆基因中插入的外源DNA序列推导出呈现的多肽序列,这9个噬菌体克隆融合多肽的核心序列为WKXRKXFXKXXG,LBP分子一级结构中有一个与多肽序列相似的序列,位于LBP分子的91-102位氨基酸WKVRKSFFKLQG,LBP的91-102位氨基酸片段可能为其致炎功能位点。 4. LPS内化抑制实验发现,3个噬菌体克隆具有抑制LBP增强LPS内化作用的活性;细胞因子生成抑制实验表明,这3个噬菌体克隆均无抑制LBP增敏LPS诱导PBMC分泌TNFα 的作用,这3个噬菌体克隆所展示的融合多肽具有抑制LBP抗炎作用的活性。这3个噬菌体克隆融合肽DNA序列一致,推导融合表达的12肽序列为FHTRWNYWPYLH,可以模拟LBP的抗炎功能位点。LBP分子一级结构中没有与FHTRWNYWPYLH相似的序列,提示该序列可能是LBP与LPS结合的一个模拟位点,而不是线性位点。 5. 应用FMOC固相合成法成功合成LBP致炎活性抑制肽,多肽序列为LBP91-102氨基酸序列WKVRKSFFKLQG-NH2,纯度在95%以上,分子量1523.6,与理论值相符。合成的LBP致炎作用抑制肽可显著抑制LBP增敏LPS诱导PBMC分泌TNFα 的活性。 结论: 1. 本研究成功的从噬菌体随机12肽库中筛选获得了可与LBP竞争结合LPS的噬菌体克隆。 2. 筛选获得的具有特异抑制LBP致炎作用的噬菌体克隆展示肽的核心序列为WKXRKXFXKXXG,与LBP分子的91-102位氨基酸WKVRKSFFKLQG有明显同源性,LBP的91-102位氨基酸序列WKVRKSFFKLQG可能为其致炎功能位点。 3. 筛选得到的具有特异抑制LBP抗炎作用的噬菌体克隆展示肽的序列为 WP=12 FHTRWNYWPYLH,可以模拟LBP的抗炎功能位点。该序列与LBP分子一级结构同源性低,提示FHTRWNYWPYLH可能是LBP与LPS结合的一个模拟表位,可以模拟LBP的抗炎功能位点。 4. 应用FMOC固相法成功合成12肽WKVRKSFFKLQG-NH2,此多肽具有显著抑制LBP增敏LPS诱导PBMC分泌TNFα 的活性。 上述研究研究结果对于阐明LBP在LPS所致内毒素血症中的分子结构基础,为进一步研究内毒素血症中致炎和抗炎的平衡关系奠定基础,并为内毒素血症的防治探索新途径。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 程云,罗清华,周继文,杨守纯,韩风连,戌广亚,曹阳,季伟;抗HBV Pre S2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达[J];中华肝脏病杂志;1996年02期
2 张成;一种简便高效筛选噬菌体克隆的方法[J];中华医学遗传学杂志;1994年05期
3 徐德斌,钱桂生,侯一峰,赵晓利,陈维中,李淑萍;噬菌体展示短肽模拟脂多糖结合蛋白抗炎功能位点的研究[J];第三军医大学学报;2004年07期
4 朱小华,吴华;肝癌特异性结合肽的筛选及鉴定[J];中华核医学杂志;2004年06期
5 罗海波,郑山根,朱平,富宁;大肠杆菌脂多糖2630模拟位的研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2004年06期
6 李文君,谭艳,陈政良;C1q结合十二肽的筛选与初步鉴定[J];免疫学杂志;2004年06期
7 郭海萍,罗海波,刘艳君,朱平,富宁;利用噬菌体肽库筛选可结合TNF-α的短肽序列[J];第一军医大学学报;2002年07期
8 武婕,张宏斌,王捷,杨太成,冼江,杨传红,郑文岭,陈惠鹏,王清明;从随机肽库中筛选血管内皮生长因子的抑制剂[J];中华肿瘤杂志;2002年06期
9 赖克方,黄海鹭,钟南山;从噬菌体随机肽库中筛选拮抗IL-5的抑制多肽[J];中华微生物学和免疫学杂志;2004年05期
10 徐德斌,钱桂生,侯一峰,赵哓利,陈维中,李淑萍;对脂多糖结合蛋白致炎的多肽序列分析[J];重庆医学;2004年05期
11 罗海波,郭海萍,刘北一,朱平,富宁;模拟HIV-1 gp41 CHR表位短肽的筛选及研究[J];免疫学杂志;2002年04期
12 郑山根,朱平,刘北一,富宁;鼠伤寒脂多糖表位模拟位的筛选[J];第一军医大学学报;2003年02期
13 李文君,张丽芸,陈政良;从噬菌体随机环七肽库筛选可模拟C1qR的C1q结合肽[J];现代免疫学;2004年05期
14 韩照中,苏国富,黄翠芬;利用噬菌体展示文库筛选纤维素结合结构基元[J];生物化学与生物物理学报;1998年03期
15 罗海波,刘北一,刘艳君,朱平,富宁;从噬菌体环肽库中筛选TNF-α表位模拟肽的研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2003年04期
16 施为,谢红付,龙剑,陈翔;抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体对噬菌体随机12肽库的免疫筛选[J];中华皮肤科杂志;2004年01期
17 龙剑,谢红付,施为;抗TNF-α单克隆抗体对噬菌体随机12肽库的筛选[J];医学临床研究;2003年04期
18 魏惠永,江丽芳,方丹云,郭辉玉;登革2型病毒E蛋白免疫优势表位的筛选鉴定[J];中华微生物学和免疫学杂志;2003年07期
19 郑山根,刘北一,朱平,富宁;交叉保护性抗LPS多克隆抗体的制备与LPS多表位模拟肽的筛选[J];中华微生物学和免疫学杂志;2003年11期
20 刘北一,李一,王莉,于春雷,杨贵贞,富宁,周长城,齐杰,周慧,李惟;利用噬菌体肽库确定IL-2Rα表位序列[J];中国免疫学杂志;1999年12期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 罗海波;刘北一;刘艳君;朱平;富宁;;以特异性噬菌体克隆为靶筛选TNF-α结合肽的研究[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
2 杨渝珍;;利用生物工程技术筛选生物活性肽——噬菌体表面展示肽库的研究和应用进展[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第七届第十四次学术年会论文摘要集[C];2003年
3 颜玲娣;宫泽辉;秦伯益;;从噬菌体十二肽库中筛选吗啡的抗原模拟表位[A];中国药理学会第八次全国代表大会暨全国药理学术会议论文摘要汇编[C];2002年
4 武婕;陈惠鹏;张宏斌;王捷;郑文玲;;筛选与KDR有结合活性的小肽[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
5 高士争;李卫真;张曦;尹革芬;段刚;;抗脂肪细胞特异膜蛋白scFv噬菌体抗体库的构建及可溶性表达[A];中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第六次学术交流会论文集[C];2004年
6 武婕;陈秋霞;邹丽容;李晖;周杰;莫艳玲;柯昌文;;特异结合人禽流感病毒H5N1的scFv分子性能鉴定[A];2010广东省预防医学会学术年会资料汇编[C];2010年
7 颜玲娣;宫泽辉;秦伯益;;从噬菌体十二肽库中筛选吗啡的抗原模拟表位[A];中国药理学会第八次全国代表大会论文摘要集(第二部分)[C];2002年
8 路秀英;杨贵贞;;应用噬菌体展示短肽探索腺病毒表位[A];第七届中国抗炎免疫药理学术会议论文摘要集[C];2000年
9 孙庆莉;王多春;阚飙;李红;;泰泽氏病原体抗原表位相关肽的初步筛选与鉴定[A];中国实验动物学会第六届学术年会论文集[C];2004年
10 王鑫杰;赵钦;赵冀楠;党露;周恩民;;禽和猪戊型肝炎病毒共有抗原表位的鉴定[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李国菊;KGF噬菌体活性肽构建及防治放射性口炎的实验研究[D];山东大学;2012年
2 宗宪磊;KGF和TGF-β1噬菌体模拟肽改善创面愈合质量的实验研究[D];山东大学;2010年
3 徐德斌;脂多糖结合蛋白功能位点分析及其抑制性多肽的筛选[D];第三军医大学;2004年
4 王瀚;人结直肠癌多肽探针的实验研究[D];陕西师范大学;2013年
5 陈益国;金葡菌肽聚糖模拟肽疫苗候选保护性作用的初步研究[D];南方医科大学;2011年
6 纪滨;噬菌体肽库筛选MT1-MMP特异性亲和肽在肿瘤显像中的基础研究[D];吉林大学;2012年
7 郑山根;LPS多表位模拟肽及抗原性的研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
8 徐岩;基于蛋白质结构的多肽与类似物的设计,合成及在生物医学中的应用[D];吉林大学;2013年
9 曾燚华;生殖支原体MgPa模拟表位的筛选与鉴定及其MAP免疫效果的观察[D];南华大学;2012年
10 李雪松;整合素αvβ3特异性结合短肽筛选及功能分析[D];第三军医大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 单雪;人食管癌细胞特异性结合肽的噬菌体肽库筛选及鉴定[D];吉林大学;2012年
2 裴亚峰;赭曲霉毒素A无毒免疫学快速检测方法的研究[D];河南科技大学;2012年
3 孙文霞;结核分枝杆菌抗原模拟肽纳米金生物传感器诊断结核病的研究[D];湖南师范大学;2011年
4 赵红蕾;肝癌细胞特异结合肽的筛选及与抗菌肽融合产物的抑瘤活性[D];吉林大学;2012年
5 唐波;VPAC1特异性结合多肽配体筛选与鉴定的研究[D];第三军医大学;2013年
6 贾彦琼;玉米赤霉烯酮无毒ELISA检测方法的初步建立及脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟表位的筛选[D];暨南大学;2013年
7 黄伦亮;广谱趋化作用抑制剂的体内筛选及其活性鉴定[D];暨南大学;2010年
8 刘淑均;采用噬菌体肽库筛选Rh(D)血型抗原模拟表位及其鉴定[D];安徽医科大学;2013年
9 杨廷亚;应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立[D];南京农业大学;2011年
10 丁艳;肺结核患者外周γδT细胞Vδ2-CDR3序列特征及其合成多肽结合抗原肽的筛选和鉴定[D];蚌埠医学院;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978