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铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性及其基因组学的研究

黄建军  
【摘要】:噬菌体是细菌的病毒,广泛存在于自然环境之中。噬菌体是细菌之间基因水平转 移的重要载体,是除质粒之外的一股重要基因流,在细菌基因组的进化、细菌的致病 性和耐药性中具有非常关键的作用。溶原性噬菌体通过自身及其携带的外源性遗传物 质改变着宿主菌及其自身的基因组构成,从而改变宿主菌的生物学性状,导致溶原性 转换。近年的研究表明,多价噬菌体和经人工改造形成的“广宿主谱”噬菌体在细菌 感染性疾病的治疗上有着巨大的前景,对噬菌体展开广泛和深入的研究具有重要的基 础意义和潜在的临床价值。因此国际上对噬菌体及其基因组学的研究再度成为微生物 学研究的热点之一。 到 2004 年 2 月底,完成全基因组测序并在 GenBank 上登录的噬 菌体已有 214 个,其中仅 2003 年以来就有 75 个。本文以我室新发现的一株铜绿假单 胞菌噬菌体 PaP2 为研究对象,首先探讨其生物学特性;然后进行基因组测序并鉴定 基因组末端的性质和粘着序列;继之,分离衣壳蛋白进行 N-端测序并确定其编码基因; 最后对基因组进行初步注释。研究内容及其结果主要包括以下几个方面。 ⒈ 铜绿假单胞菌噬菌体 PaP2 生物学特性的研究。①电镜观察发现,PaP2 有一个 多面体立体对称的头部,头部直径约为 52nm,无囊膜,有一短尾,长约 16nm,宽约 5nm。属短尾噬菌体。②PaP2 是溶原性噬菌体,产生半透明噬斑,在其溶原性宿主菌 基因组上有前噬菌体的存在。③PaP2 感染其宿主菌铜绿假单胞菌 PA2 的最佳感染复数 是 10。④根据一步生长曲线可知,PaP2 感染宿主菌的潜伏期约为 90min,爆发期约为 75min,爆发量约为 34。 ⒉ 噬菌体 PaP2 基因组的一般概况。①基因组测序表明该基因组全长为 43783bp, 其碱基组成是:A = 26.59%,G = 22.73%,T = 28.05%,C=22.63%,C+G =45.36%, 其 C+G 含量远低于宿主菌铜绿假单胞菌(66%)。②基因对密码子使用频率及其偏嗜性 的分析结果表明,噬菌体 PaP2 和宿主菌使用遗传密码子都具有非常明显的偏嗜性, 但两者的偏嗜性显著不同,表明 PaP2 进入铜绿假单胞菌体内寄生的历史并不久远。 *本项目受到重庆市攻关项目资助(No.6458) 7 WP=13 第三军医大学博士学位论文 ③基因组的物理图谱和电子酶切图谱的比较分析表明,噬菌体 PaP2 的基因组是线性 dsDNA。④基因组末端性质的研究确定了 PaP2 具有固定的 5’-突出的粘性末端。噬菌 体 PaP2 基因组 5’-末端的粘着序列是:5’-TCAGGCTATAGTGGTT-3’,基因组 3’-末端 的粘着序列是:5’-AACCACTATAGCCTGA-3’,二者反向互补。⑤GC 岛的分析表明 PaP2 基因组上 GC 分布相对比较均匀,但也发现了 6 个大于 200bp 的 GC 岛。其中 G+C 含量偏离最大的两个基因,即基因 1 和基因 13 很可能是水平转移而来的外源基 因。 ⒊ 基因组的生物信息学分析以及基因功能的探讨。在 PaP2 基因组中具有 156 个 大于 100bp 的 ORFs,其中 58 个推定为编码基因,编码序列总长度为 43965bp,基因 的平均 DNA 长度为 758bp。在整个基因组 DNA 中,平均每 755bp 长度中有一个推定 基因,基因组中碱基的使用率达到 93.66%。在核苷酸水平,58 个推定基因与目前已知 的所有序列都没有同源性。通过 blastp 检索,在公共数据库中找到了 4 个推定基因编 码产物的同源蛋白质,可初步确定其功能,它们是:基因 31 编码 DNA polymerase I, 基因 54 编码产物是核酸外切酶,基因 7 编码与噬菌体装配有关的蛋白质,基因 26 产 物的功能可能与 DNA 复制、转录等有关系;通过 FASTA 检索,在公共数据库中又新 找到了 2 个推定基因编码产物的同源蛋白质,可初步确定其功能:基因 19 可能编码与 噬菌体颗粒形成有关的蛋白质,基因 29 编码产物可能是一个抗限制性内切酶蛋白质; 根据 blastp 和 FASTA 检索的相似性结果,同时结合噬菌体基因组织的特点,可初步推 定基因 12、21、22 编码的产物可能是噬菌体的衣壳蛋白。进而,利用 DNAStar 软件 包中的 MegAlign 软件对初步鉴定功能的基因编码产物及其同源性蛋白质进行了多重 比对并绘制了系统发生树,以分析其进化关系。 ⒋ 噬菌体衣壳蛋白及其编码基因的确定。本研究结果显示,噬菌体颗粒至少含有 10 个衣壳蛋白,其中,192kD、75.3kD、59.9kD 蛋白是噬菌体的主要衣壳蛋白。将电 泳分离的蛋白质转印至 PVDF 膜上进行 N-端氨基酸测序。将 N-端测序得到的氨基酸 残基序列与所有推定基因编码产物的 N-端氨基酸序列相比对,确定了噬菌体 6 个衣壳 蛋白的编码基因,它们是:基因 8 编码 75.3kD 蛋白质、基因 11 编码 30.5kD 蛋白质、 基因 13 编码 47.2kD 蛋白质、基因 23 编码 32.3kD 蛋白质、基因 24 编码 59.9kD 蛋白 质、基因 25 编码 192kD 蛋白质。 ⒌ 基因组的非编码序列分析表明在基因组上存在着 30 个长短不一的基因间区 (1-329bp),其总长度是 1909bp。在基因组的 5’-、3’-末端分别存在 379 和 100bp 的非 编码序列。基因组非编码区还存在 4 个反向重复序列、1 个正向重复序列以及 2 个串 8 WP=14 第三军医大学博士学位论文 联重复序列。这些重复序列可能与转录调节、DNA 重组以及基因组进化


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