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人CD4~+CD25~+ T细胞与CD4~+ CD25~+ T细胞差异蛋白质组学研究

彭双发  
【摘要】:机体形成和维持免疫耐受的机制有很多,除了胸腺阴性选择以及外周T细胞无能等被动性机制之外,研究证明还存在主动性机制,即通过调节性T细胞下调其他细胞的免疫反应从而维持免疫耐受。从1995年首次发现清除天然CD4~+CD25~+T细胞后发生自身免疫病而补充该细胞则可以防止其发生以来,越来越多的研究证明天然CD4~+CD25~+T细胞具有调节性T细胞特性,CD4~+CD25~+T细胞对机体中自身反应性T细胞和部分效应性T细胞的选择性抑制是免疫自稳形成和维持的重要机制之一,近来该细胞在自身免疫、移植免疫和肿瘤免疫等领域越来越受到瞩目。 虽然该细胞功能肯定,但其功能的分子机制仍不明确,如:其免疫调节效应是通过接触性机制抑或细胞因子途径?CD25是T细胞活化的一个标志,CD4~+CD25~+调节性T细胞与免疫反应后活化的CD4~+CD25~+T细胞有何不同?是否还有比CD25更为特异的标志物待发现? 后基因组时代的差异蛋白质组学为我们在全貌性分析蛋白质组表达差异的基础上探索细胞分子机制提供了可能。双向凝胶电泳和基质辅助飞行时间质谱是差异蛋白质组学常用的支柱性技术。在功能相关分子、标志物和药物靶位筛选研究中的应用显示了此二种技术的价值。 本文通过对人CD4~+CD25~+T细胞以及CD4~+CD25~-T细胞的蛋白质组表达差异分析以及差异蛋白的鉴定,以期探索CD4~+CD25~+T与CD4~+CD25~-T细胞功能差异的分子基础,为进一步筛选特异性功能相关蛋白和干预靶位提供基础。 首先,我们应用磁珠分选法从人脾脏中成功分离纯度较高的CD4~+CD25~+T与CD4~+CD25~-T细胞并对其功能进行了功能试验分析,结果发现人脾脏源性天然CD4~+CD25~+T细胞具有免疫低反应性并且对CD4~+CD25~-T免疫反应有明显抑制作用。即说明人脾脏源性天然CD4~+CD25~+T细胞具有调节性细胞特性。与人CD4~+CD25~-T细胞功能存在明显差异。 随后我们用双向凝胶电泳技术对分选的CD4~+CD25~+T细胞CD4~+CD25~-T细胞全蛋白质进行分离,获得了对全细胞蛋白质较好显示的凝胶,通过运用图象分析软件对数字化量化比较分析,建立了蛋白质组差异表达图谱。二种细胞的蛋白质组在分布模式上大体相似,蛋白质点集中显示于等电点介于pH4至8和分子量介于14kDa至65kDa的范围,CD4~+CD25~-T细胞胶图上平均显示704个点,CD4~+CD25~+T细胞平均685个点。软 第三军医大学博士研究生论文 件分析比对,发现表达水平差幅在4倍以上的共有25个蛋白质点,其中17个在 CD4+CD25-T细胞表达水平较高,而8个点在CD矿CD25+T细胞表达水平较高。 最后,我们切取25个差异蛋白点进行胶内酶解,运用肚质量指纹谱鉴定策略,从 中成功鉴定15个点,其中CD4+CD25.T细胞13个,CD4+CD25+T细胞2个。在成功鉴定 的蛋白质点中,CD4+CD25T细胞表达水平较高的蛋白质包括多种代谢相关酶类和结构 蛋白,还有信号转导相关蛋白(LCKBPI)、热休克蛋白70分子伴侣家族成员(Bip蛋 白),信号分子lasp一1,凋亡相关分子(casPase一7B链)等,CD4十cD25+T细胞表达水平 较高的二种均为核酸代谢相关蛋白质。 上述结果为相关分子进一步功能研究奠定了基础。


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