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严重烧伤和缺氧后心肌HIF-1α的变化及其作用研究

党永明  
【摘要】:目的:观察严重烧伤后心肌组织及缺氧培养条件下心肌细胞中HIF-1 α的表达变化规律及其作用,并分析其作用机制。 方法:实验模型1、乳鼠心肌细胞在1%O_2、5%CO_2和94%N_2的混合气体中培养,制作缺氧模型。2、比较并筛选HIF-1 α干扰片段,构建最佳干扰双链干扰RNA(dsRNAi),转染筛选后的有效si-HIF-1 α-RNAi,进行缺氧培养。3、Wistar大鼠40%Ⅲ°烫伤模型检测指标1、用HPLC法测定培养心肌细胞ATP、ADP、AMP含量,并计算能荷及ATP/ADP比值。2、测定糖酵解关键酶(HK、PFK、LDH)的活性以及培养液中乳酸含量的变化。3、分别用Western-blotting和RT-PCR测定了心肌细胞及心肌组织中HIF-1 α蛋白及mRNA含量的变化。4、运用免疫组化技术,观察HIF-1α蛋白的表达与定位活化。 结果: 1、筛选出HIF-1 α最佳干扰片段序列。 正4′-CAA AAA CTG TAA AAA GAG CAC AGT TAC AGG ATT CGG TGT TTC GTC CTT TCC ACA AGA-3′ 反5′-CAA AAA CTG TAA AAA GAA TCC TGT AAC TGT GCT CGG TGT TTC GTC CTT TCC ACA AGA-3′ 2、缺氧可诱导心肌细胞中HIF-1 α的mRNA水平,蛋白水平增高。缺氧后半小时HIF-α迅速于细胞浆表达,1小时后细胞核内大量表达,出现核移位现象。转染有效RNA干扰片段后,缺氧处理后各时相点HIF-1 α mRNA水平较单纯缺氧组均有非常显著的降低,蛋白水平1小时内增高,其后迅速下降,其中缺氧1、3、6、12小时组均明显低于单纯缺氧组相应时相点。 3、缺氧心肌细胞内糖酵解酶HK、PFK和LDH活性显著升高,培养液中乳酸的含量也很快成倍增加。si-HIF-1α-RNAi组与单纯缺氧组相比HK、PFK和LDH活性增高不明显。培养液中乳酸的含量增长速度相对较慢。 4、心肌细胞缺氧时,ATP含量明显下降,其后(缺氧3-12h)维持在一较低水平,形成一缓慢变化时期,缺氧12-24h再次快速下降,达到最低,ADP、AMP含量缓慢 第三军医大学硕十学位论文 升高,变化趋势与ATP相反;si一HIF一1。一RNAi组与单纯缺氧组相比,ATP含量下降 快速,无维持缓慢变化阶段,于6一12小时达到最低水平,ADP、AMP含量则快速升 高。能荷,ATP/ADP比值的变化趋势与ATP相似。 5、40%Hl“烫伤后大鼠左、右心室组织HIF一1 0 mRNA、蛋白含量随伤后时间延 长而逐渐增高,12小时达高峰。正常左、右心室内均有HIF一1 0 mRNA、蛋白表达。 烫伤后左、右心室内HIF一1 QmRNA、蛋白表达不同,左心室量明显高于右心室。 结论: 1、本研究首次运用转染ddRNAi表达框法,在乳鼠心肌细胞中成功构建HIF一1。 低表达模型,为全方位、深入的研究心肌细胞中HIF一1。的功能提供了良好的实验平 台。与传统的基因敲除、RNA干扰技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操作简 单等优势,具有较好的操作性和广阔的应用前景。 2、HIF一la缺氧过程中的表达与缺氧的时间、程度密切相关。心肌细胞内HIF一1 Q在缺氧CI.5小时达到高峰,免疫组化观察发现在缺氧0.5小时HIF一IQ主要位于细胞 浆,缺氧1小时才‘大量出现核内表达,可能存在核移位受阻,原因可能为缺氧使微管 受损,延缓了核移位。 3、本实验观察到:缺氧可使心肌细胞内HIF一1 0 mRNA水平,蛋白含量表达增加, 糖酵解酶HK、PFK、LDH活性显著增高、培养液中LC浓度大幅度增加,ATP和能 荷水平,在快速降至一较低水平后,维持一段时间,缺氧12小时后进一步下降;而 ADP和AMP变化正好相反,逐渐增高。由于HK、PFK、LDH为HIF一IQ下游调控基 因,我们推想:氧分压降低可诱导HIF一1。表达增强,从而促进HK、PFK、LDH表 达、活性的上调,糖酵解供能增加,缓解了细胞能量供应匾乏状态。 4、采用转染ddRNAi表达框抑制心肌细胞HIF一1。的表达后发现:缺氧使糖酵解 酶的活性增高减少,ATP和能荷水平持续快速下降,较正常心肌细胞提前进入不可逆 损伤状态,表明HIF一1。低表达使细胞对缺氧的适应能力下降,进一步反证表明缺氧 诱导因子具有明确的细胞保护作用,其机制为缺氧诱导HIF一l。的高表达增强了无氧 糖酵解供能,为细胞延长了生存时间。 5、首先发现大面积重度烧伤可以诱导大鼠心肌组织HIF一1 0 mRNA水平增加,蛋 白表达增加,其增加的幅度与J自肌缺血、缺氧程度密切相关。而且发现,正常左、右 沪心室内均有HIF一1 0 mRNA、蛋白表达。烫伤后左、右J自室内HIF一1 a mRNA、蛋白表 达不同,左心室量明显高于右心室。HIF一1。心肌组织中的表达,通过加强心肌供能, 减轻心肌缺血、缺氧性损害的作用对烧伤后心肌细胞损伤具有一定保护作用,左心室 第二军医大学硕士学位论文 较右心室可能更加耐受缺氧。 鉴于上诉几点认识,我们认为HIF一1。对烧伤和缺氧心肌具有明显的细胞保护作 用,上调其表达,可为临床心肌缺血的防治提供新的思路和方法。


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