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线粒体在硫芥诱导大鼠脾淋巴细胞毒性中的作用机制研究

曾惠  
【摘要】:硫芥中毒导致免疫系统抑制,进而严重影响着病人的生活质量。淋巴细胞是机体免疫系统重要成分,它的数量和质量直接反应机体免疫系统功能,又可间接反应机体造血功能。硫芥诱导细胞死亡有两种方式:细胞坏死和细胞凋亡。有研究证实,硫芥引起的细胞毒性存在量效关系和时效关系。目前硫芥诱导的淋巴细胞毒性机制尚未完全阐明,因而也缺少有效的防治措施。 目的 我们以线粒体为研究目标,从硫芥对离体淋巴细胞毒性(凋亡)作用研究和硫芥对整体动物免疫器官及淋巴细胞的影响,从氧化应激状态变化、线粒体跨膜电位改变、Cyt-c释放以及线粒体结构变化等方面研究线粒体功能状态与硫芥的淋巴细胞毒性作用的关系,以进一步明确硫芥的淋巴细胞毒作用可能机制,为硫芥中毒的诊断和防治提供理论依据。 方法 (1)离体细胞染毒模型:分离Wistar大鼠脾脏的淋巴细胞进行培养。对淋巴细胞进行HE染色,以DNA断裂分析作为淋巴细胞损伤(凋亡)的标志;GSH、GSSG的变化,揭示细胞氧化应激状态的改变。以罗丹明123标记的荧光探针检测线粒体跨膜电位;Western blot、免疫组化检测线粒体Cyt-c释放;透射电镜观察线粒体超微结构的改变。(2)整体动物中毒模型:将Wistar大鼠随机分为正常对照组和实验组。腹腔注射硫芥(0.6 LD_(50),1.92mg/kg),对照组以等量生理盐水代替。观察大鼠硫芥中毒临床症状并作记录。于中毒后2h、6h、12h、24h等时相点活杀动物取样。用紫外分光光度计法检测组织及线粒体内SOD、ROS、MDA、Cyt-c的变化,用荧光分光光度法检测GSH、GSSG的变化。用还原一氧化差光谱法测定线粒体呼吸链细胞色素成分改变。苏木素—伊红染色检测脾脏组织形态学变化。(3)硫芥染毒淋巴细胞线粒体保护试验:应用离体染毒模型,设三个剂量组,每个剂量组有相应的GSH保护组做对照。采用MTT测定线粒体整体功能,用荧光分光光度法检测GSH,DNA断裂分析作为对细胞死亡抑制标志 结果 (1)硫芥处理的淋巴细胞HE染色出现凋亡样改变,琼脂糖凝胶显示DNA片段的梯带现象(DNA ladder);(2)硫芥处理淋巴细胞后4h线粒体△ψm即明显下降, 第三军医大学硕士学位论文 线粒体膜通透性和细胞还原状态(细胞内GSH含量)呈直线正相关;线粒体整体功能 (MTT)结果在中毒4h即降低,线粒体整体功能和细胞还原状态(细胞内GSH含量) 呈直线正相关;线粒体膜通透性和线粒体整体功能呈直线正相关。(3)硫芥作用后4h, Cyt一c条带浓度明显比增加,一直持续至中毒后8h,免疫细胞化学法显示出中毒后4h, Cyt一c的释放明显增加。(4)中毒大鼠无明显临床中毒症状,也无明显的脏器异常;脾脏 组织病理学发生改变的同时,表明氧化还原状态的生化指标也在改变,脾脏线粒体呼 吸链细胞色素成分也有不同程度的丢失。(5) GSH能维持线粒体功能状态,抑制凋亡发 生。 结论上述结果提示:(1)硫芥引起的淋巴细胞死亡的方式有两种:凋亡和死亡, 线粒体在此过程中起着重要作用。(2) 100拼m0FL硫芥诱导淋巴细胞凋亡,线粒体形态 结构发生了改变。(3)淋巴细胞和线粒体内GSH(可通过清除线粒体自由基以维护线粒 体功能)参与了硫芥诱导的淋巴细胞凋亡过程。线粒体膜通透性和线粒体功能状态分 别与细胞内GSH呈正相关(r0.85,双侧p0.05);Ros的增加、GsH减少等导致 淋巴细胞氧化应激状态变化,致使细胞线粒体跨膜电位溃散。(4)硫芥中毒后,跨膜电 位溃散可使细胞线粒体Cyt一c释放至胞浆(线粒体PT孔的开放是Cyt一c释放的前提)。 在硫芥中毒整体动物脾脏中也有cyt一c的丢失。(5)线粒体功能保护与硫芥淋巴细胞毒 性的关系试验显示:可以从线粒体途径来拮抗硫芥诱导的淋巴细胞毒作用,如用GSH。 (6)低剂量(0.6 LDS。)硫芥中毒能使整体动物免疫器官发生病理生理学改变,但无明 显的临床症状出现。 通过本课题的初步研究,可以看出线粒体在硫芥诱导淋巴细胞凋亡的作用机制为: 硫芥染毒后,产生细胞死亡信号(如GSH减少等)传递到线粒体,使其产生PT和跨 膜电位下降,引发包括能量代谢下降、ROS生成、储存钙离子外流、cyt一c和AIF释 放等一系列效应,诱导凋亡的发生。我们可以从线粒体途径来拮抗硫芥诱导的淋巴细 胞毒作用,如用GSH。


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