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线粒体损伤在NAFL大鼠肝细胞凋亡中的作用

樊丽琳  
【摘要】:目的:通过研究线粒体损伤在大鼠NAFL肝细胞凋亡中的作用,探讨NAFL的发病机理。 方法:(1)30只Wistar雄性大鼠随机分为基础饲料组(正常对照组,C组)、高脂饲料组( 脂肪肝组,F组),其中每组各含4周、8周、12周3个时相点,每时相点5只动物。(2)动态观察各组:①体重变化;②HE染色光镜观察肝脏组织病理改变;③电镜观察肝细胞超微结构变化;④Clark氧电极检测肝脏线粒体呼吸功能,荧光分光光度计测定线粒体膜电位;⑤硫代巴比妥酸法测定肝脏组织丙二醛(MDA)的含量变化;⑥流式细胞仪检测肝细胞凋亡百分数;⑦免疫组织化学法及Western blot检测Cyt C、Caspase-3、Bcl-2、Bax在肝脏中的表达。 结果:①体重情况: F组4周、8周、12周,体重分别为355.5±28.3g、406.2±14.5g、469.7±28.9g,而C组为244.9±16.9g、282.5±20.1g、300.7±15.8g,F组体重均高于同一时相点的对照组,差异具有显著性(P0.01);②HE染色结果显示:C组大鼠肝脏无异常发现;F组肝脏在4周时出现脂肪变, 8周出现轻度脂肪肝,12周出现中、重度脂肪肝;电镜下观察高脂12周肝组织,肝细胞线粒体肿胀,嵴变短、减少甚至消失,并发现染色质浓染,边集于核膜;③F组大鼠肝脏线粒体RCR(呼吸控制率)、P/O(磷/氧比值)比值随饲养时间的延长逐渐下降,高脂4、8、12周RCR分别为:4. 84±0.18、3.87±0.44、3.51±0.18,C组4、8、12周RCR分别是:4.74±0.38、4.93±0.79、4.85±0.47,F组4周与C组4周无显著差异,而F组8、12周与相应时相C组比较,RCR显著降低(P0.05或P0.01), F组4、8、12周P/O比值3.61±0.39、3.56±0.34、3.37±0.25较C组相应时相点(4.22±0.63、4.11±0.29、4.13±0.39)均降低,具有显著性意义(P0.05或P0.01); ④C组4、8、12周线粒体膜电位相对荧光强度分别为951.2±64.6、977.2±78.3、958.6±70.4,组间无明显差异,而高脂4、8、12周线粒体膜电位相对荧光强度分别833.1±53.5、772.2±73.4、587.2±63.1,呈逐渐下降趋势,与相应时相C组比较明显降低,差异显著(P0.05或P0.01);⑤第4周后肝脏内MDA含量在F组明显高于对照组(P0.05),随时间延长,F组MDA逐渐增 WP=8 加;⑥F组4周肝细胞凋亡百分数(4.2±0.4)与C组肝细胞(4.1±0.3)无明显差异,但F组8周、12周肝细胞凋亡百分数明显增加,分别为9.2±0.4、11.6±1.1,C组8、12周分别为4.3±0.3、4.3±0.2,具有显著差异(P0.01);⑦免疫组织化学染色显示:Cyt C在C组肝细胞胞浆中呈黄色细颗粒,均匀分布,在F组随着时间延长,染色加深,呈片状分布,范围扩大。Caspase-3在C组肝脏中呈散在分布,胞浆内着色,弱阳性,F组4周散在分布,着色较正常加深,F组8、12周着色逐渐加深,阳性细胞数增加,呈现弥漫阳性;Bcl-2、Bax在C组的表达均为散在弱阳性,F组4、8、12周阳性细胞数渐增加,并在脂肪变明显的部位着色深;⑧Western blot检测结果显示:F组Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的表达随着时间延长增高,尤以F组8周及12周增加明显,与C组比较,差异具有显著性(P0.05或P0.01);随着脂肪肝的进展,Bcl-2 / Bax比率逐渐下降,Cyt C在F组4周、8周、12周较C组明显增加(P0.05),但F组间比较无明显差异。 结论:1、NAFL大鼠肝细胞凋亡在NAFL的发生、发展中具有重要作用,脂肪变越重、炎症越明显的肝组织,肝细胞凋亡越多;2、肝脏线粒体功能损伤在NAFL发病机制中起关键作用,肝脏脂肪变程度越重,其线粒体功能损伤越明显,并在单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎进展的过程中起重要作用;3、线粒体呼吸功能损伤后引起的脂质过氧化、氧应激,引发了线粒体膜电位下降,启动了Cyt C由线粒体向胞浆内释放, 激活Caspase家族的级联反应,最终导致NAFL肝细胞凋亡;4、在NAFL 发生过程中,Bcl-2、Bax均被诱导,但二者表达的相对比例异常,参与了对NAFL肝细胞凋亡的调控。


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